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1、ABO血型鉴定及HBSAg测定,廖振林 食品学院 2006年秋,凝集反应,【实验目的】1了解凝集反应的原理、基本类型及其临床意义。2掌握玻片凝集实验、间接凝集实验的实验方法和结果分析。,【概述】,在一定浓度的电解质溶液中，颗粒性抗原与相应抗体结合后，出现肉眼可见的凝集块，称为凝集反应。凝集反应是一种定性的检测方法，也可以进行半定量检测。凝集反应可分为直接凝集反应和间接凝集反应。由于凝集反应方法简便，目前在临床检验中仍被广泛应用。,一、直接凝集反应细菌、细胞等颗粒性抗原，在适当电解质参与下可直接与相应抗体结合出现凝集，称为直接凝集反应 。常用的凝集试验有玻片法和试管法两种。 玻片凝集试验ABO血
2、型鉴定玻片凝集试验为定性试验，一般用已知抗体作为诊断血清，与受检颗粒抗原，如菌液或红细胞抗原各加一滴在玻片上，混匀，数分钟后即可用肉眼观察凝集结果，出现凝集颗粒的为阳性。此法简便，快速，适用于从病人标本中分离得到的菌种的诊断或分型，也可用于红细胞ABO血型的鉴定。,【实验原理】人类ABO血型抗原主要有A和B两种，根据红细胞表面这两种抗原的有无可把血型分为四种。据此，将抗A和抗B抗体分别与待测红细胞混合，抗A或（和）抗B抗体与红细胞表面上的相应抗原结合而引起红细胞凝集，据其凝集情况便可判定出受试者的血型。ABO血型的划分,【实验材料】1ABO血型鉴定试剂盒 内含抗A分型试剂和抗B分型试剂各1支。
3、2一次性采血针1枚、洁净玻片2块、75酒精、灭菌棉签。384消毒液,3用酒精棉签消毒被检者手指尖端，以采血针刺破皮肤，稍加挤压，使血液流出。用另一载玻片一端取适量血液加入抗A分型试剂，并混匀；用另一端再取适量血液加入抗B分型试剂，并混匀。用干棉签止血。 4观察红细胞有无凝集发生。如有凝集，可见红细胞凝集成块；无凝集，红细胞呈均匀分散。判定结果后把玻片放入消毒液中。,【实验方法】1取洁净载玻片1块，并标记（如图）,2将抗A、B分型试剂分别加 1滴于标记有A、B的玻片两侧。,抗A,抗B,【实验结果】记录受检者红细胞凝集情况，根据ABO血型鉴定表(下表)，判断受检者的血型。ABO血型鉴定表,二、间接
4、凝集反应将可溶性抗原或抗体先吸附于适当大小的颗粒性载体表面（这种载体与免疫无关），然后与相应抗体或抗原结合，在适量的电解质存在下，出现特异性凝集现象，称为间接凝集反应。根据载体的不同可将间接凝集反应分为：间接血细胞凝集试验、间接乳胶凝集试验（及间接乳胶凝集抑制试验）和金黄色葡萄球菌协同凝集试验等。,间接凝集抑制试验妊娠试验 【实验原理】可溶性抗原致敏的乳胶颗粒与相应抗体作用可使乳胶颗粒凝集，此为间接乳胶凝集试验。若使抗体先与可溶性抗原作用，再加入该抗原致敏的乳胶颗粒，则乳胶凝集被抑制，此为间接乳胶凝集抑制试验。孕妇尿中绒毛膜促性腺激素（HCG）含量明显增高。HCG与抗HCG抗体先作用后，再加入
5、HCG致敏的乳胶颗粒，不出现凝集反应，此为妊娠试验阳性；非孕妇尿中HCG含量不足以消耗掉抗HCG抗体，抗体与后加入的HCG致敏乳胶结合呈现凝集现象，则妊娠试验阴性。,【实验材料】1妊娠诊断试剂盒：内含抗血清（抗HCG）、乳胶抗原（HCG致敏）各一支2待检尿、孕妇尿、正常尿。3有格玻片和毛细吸管等。,【实验方法】1在玻片的第1、第2和第3格内分别加1滴正常尿、待检尿及孕妇尿。2每格内加入妊娠诊断试剂抗血清1滴。轻轻摇动12 min使其充分混匀。 3每格加入乳胶抗原1滴，轻轻摇动玻片35 min后观察结果，记录各标本有无凝集现象。,【实验结果】孕妇尿格呈均匀浑浊乳状液，无凝集，妊娠试验阳性；正常尿
6、格出现白色细小凝集物，随时间延长凝集物变成小块状，妊娠试验阴性。待检尿若为乳状液，妊娠试验阳性；若出现凝集，则妊娠试验阴性。,【注意事项】1试验所用诊断试剂用前应充分摇匀，而且应在有效期内使用。2加样用的滴管及混匀用的牙签不能共用。3加样不宜太多，玻片应始终保持水平，以防两格之反应液相混。,【实验思考】 1记录血型鉴定试验、乳胶妊娠诊断试验的材料、方法及结果判定（可用图示或表格方式表示）。2直接凝集试验与间接凝集试验有何不同？3在各凝集试验中都设有相应对照，有何意义？若对照出现异常如何分析及解决？,沉 淀 反 应,【实验目的】 1掌握对流免疫电泳的基本原理、方法。 2熟悉琼脂单向扩散，双向扩散
7、的基本原理、方法、结果分析及临床用途。3了解火箭免疫电泳的基本原理、方法。,【概述】可溶性抗原如血清、毒素、细菌浸出液等与相应抗体结合，当两者比例合适、并有适量电解质存在时，形成肉眼可见的沉淀物或沉淀线，称为沉淀反应。沉淀反应是临床上最常用、最基本的方法之一。它的种类较多，可分为琼脂扩散试验、免疫电泳试验、环状沉淀试验及絮状沉淀试验等。,一、琼脂扩散试验利用可溶性抗原与相应抗体在半固体琼脂内进行扩散，当两者比例合适时，就出现白色沉淀线，为阳性反应。本试验可在试管内、平皿中以及玻片上的琼脂内进行操作。琼脂扩散试验可分为单向琼脂扩散试验和双向琼脂扩散试验。(一)单向琼脂扩散试验(二)双向琼脂扩散实
8、验,二、对流免疫电泳 【实验原理】带电的胶体颗粒可在电场中移动，移动方向与胶体颗粒所带电荷有关。多数蛋白质抗原在碱性缓冲液中带负电荷，在电泳时从负极向正极移动。抗体属球蛋白，在碱性缓冲液只带微弱的负电荷，而且相对分子质量较大，电泳力较小，在琼脂电渗力作用下反而由正极向负极移动。这样就使抗原和抗体定向对流，在两孔间相遇时发生反应，并在比例合适处形成肉眼可见的白色沉淀线。这种将双向琼脂扩散和电泳技术结合在一起的方法称为对流免疫电泳 。,【实验材料】1电泳缓冲液：pH 8.6巴比妥-盐酸缓冲液。2抗体：抗AFP。3抗原：AFP阳性血清、待检病人血清。41琼脂 用pH 8.6巴比妥-盐酸缓冲液配制，冰
9、箱保存备用。5电泳仪、电泳槽、载玻片、打孔器、10 ml吸管、移液器、移液头。,【实验方法】1制板2打孔3加样 将抗原加入琼脂板上有标记孔侧的小孔中，抗体加入另一侧小孔中，以加满为度，不可溢出孔外。(如图示)4电泳 将加好样品的琼脂板置电泳槽上，抗原侧置阴极端，抗体孔侧置阳极端。搭好桥后，接通电源，控制电压610 V/cm板长，电泳约3060 min。5关闭电源，取出琼脂板，观察结果。,【实验结果】将玻片对着强光源，先观察AFP阳性血清孔与抗体孔之间的白色沉淀线，然后再观察待检血清孔与抗体孔之间是否也有沉淀线出现，如有沉淀线，则表示AFP试验阳性，否则AFP试验为阴性。,【注意事项】1电泳时电
10、流不宜过大，以免蛋白变性。2抗原和抗体的电极方向不能搞错。3抗原和抗体的浓度要适当，抗原太浓或太稀都不易出现沉淀线。4电泳所需时间与孔间距离有关，距离越大，电泳时间越长。,【实验思考】1单向扩散与火箭电泳、双向扩散与对流免疫电流比较各有何特点？2对流免疫电泳中，抗原为何放阴极端，抗体为何放阳极端？,ELISA夹心法检测HBsAg,【实验目的】1熟悉ELISA的原理、夹心法。2了解免疫标记技术的原理。 【实验原理】采用多克隆抗-HBS包被反应板，加入待测标本，同时加入单克隆抗-HBs-HRP，如待测标本中含有HBsAg时就与包被抗-HBs、抗-HBs-HRP结合形成复合物，加入TMB底物（3，3
11、 ，5，5“-四甲基联苯胺）产生显色反应，反之就无显色反应。,【实验材料】1乙肝病毒HBsAg酶联免疫诊断试剂盒（由厂商供应）。预包被微孔条（用纯化的抗-HBs包被）。酶联试剂（用HRP标记的抗HBs）。HBsAg阳性对照。HBsAg阴性对照。洗涤液(浓缩液)。显色剂A、B。终止液（2 mol/L H2SO4）。2微量加样器，混合振荡器，酶标测定仪，恒温箱，吸水纸，蒸馏水等。,【实验方法】1配液 浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水25倍稀释使用。2编号 将微孔条固定于支架，按序编号。3加样 分别用加样器加待检血清和阴、阳性对照50 1（1滴）于相应孔中，设空白对照孔（加50 1洗涤液）。4加酶 除空
12、白对照外，每孔加酶联试剂50 l（1滴）。5温育 振荡混匀，置37 30 min后取出。6洗涤 甩去孔内液体，扣干，用洗涤液注满各孔，静置2 s，甩干，重复5次后拍干。7显色 每孔加显色剂A、B各50 l（1滴）振荡混匀，37暗置15 min。,【实验结果】1目测 在白色背景下观察各孔显色情况，有明显蓝色者为阳性，无色者为阴性。2酶标仪检测 每孔加终止液50 l（1滴）混匀，用酶标仪450 nm波长测各孔A值。 计算P/N值：结果判断：P/N值2.1者为阳性，2.1者判为阴性（阴性对照孔A值小于0.05时以0.05计）。,【注意事项】1试剂盒应于4存放，在有效期内使用。2微孔条须密封防潮，从冷藏环境中取出时,应在室温中平衡至潮气尽干后方可开封启用，余者及时封存。3滴加试剂前应将瓶摇匀，使液体混匀。滴加时瓶身应保持垂直，以使滴量准确，注意勿将试剂滴在孔壁上。4洗涤时各孔均须加满，防止孔口内有游离酶未能洗净。5待测标本不可用NaN3防腐。所有样品都应按传染源处理。,THE END,
