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1、第二章 遗传图谱 第一节 遗传标记概述,遗传作图的标记,Set the flags on the genomes,一 、遗传图谱与物理图谱,遗传图谱与物理图谱 遗传作图(genetic mapping)：采用遗传学分析方法将基因或其它DNA顺序标定在染色体上构建连锁图。这一方法包括杂交实验，家系分析。遗传图距单位为厘摩（cM），每单位厘摩定义为1交换率。 物理作图（Physical mapping）：采用分子生物学技术直接将DNA分子标记、基因或克隆标定在基因组实际位置。物理图的距离依作图方法而异，如辐射杂种作图的计算单位为厘镭（cR），限制性片段作图与克隆作图的图距为碱基对，即DNA的长度。
2、,遗传图谱(genetic map),遗传图谱(genetic map)又称遗传连锁图谱或连锁图谱(linkage map)。经典遗传 学时代的遗传连锁图谱主要是以家系分析或不同性状个体间杂交为基础，根据同源染色体上 等位基因的变化，通过计算重组率，确定染色体上基因座位的顺序和距离，构建基因的连锁图谱。,经典遗传图谱,人们把单倍体配子所有染色体上的全部基因称为一个基 因组。基因组内每条染色体上的连锁基因称为一个连锁群。绘制遗传图谱就是要进行每条染 色体上基因座位的顺序和距离的确定，即主要通过家系分析，对不同性状之间、性状与标 记之间、标记与标记之间的连锁遗传频率进行计算，最终绘制遗传连锁图。
3、人类遗传图谱包括女性一种配子的23条染色体(记作23，X)和男性两种配子的23条染色体(23 ，X)、(23，Y)上的所有基因位点。,现代遗传图谱,70年代发展起来的DNA重组技术、80年代发展起来的分子标记技术为拓展遗传图谱的构建途径创造了技术条件，也使基因定位的方法从细胞及染色体水平过渡到分子水平。 DNA水平的多态性标记位点作为绘制现代遗传图谱的主要界标，大大提高图谱的 精确度、准确性。遗传图谱的绘制也因此进入了一个崭新的时代。 现代遗传图谱的概念是由Botstein D等(1980)首先提出的，在此基础上，限制性片段长 度多态性RFLP作为遗传图谱的第一代崭新标记得以问世 。遗传图谱的
4、第二代标记位点是大量的可变数量串联重复（VNTR)，包括微、小卫星(MS)或短串联重复(STR 或SSLP)。第三代标记是位点极其丰富的单核苷 酸多态性(SNP)。,1、形态标记,遗传学上稳定、可见的外部特征遗传与环境、结构基因与调控基因综合作用的结果。如穗形、芒长、穗长、粒色、穗形、矮秆、卷叶等。 特点：直观简单从基因型到表现型存在基因表达、调控、个体发育等环节，表型差异有时难以反映基因型差异。,二、遗传标记的 种类,2、细胞学标记,染色体数目变异及结构变异，表现在染色体核型（数目、大小、随体、着丝点位置等）和带型（C带、N带、G带等）。随着分带、细胞原位杂交等研究技术的发展，可在染色体水平
5、揭示更多遗传变异。 特点：直观、快速而经济，但变异十分有限，当染色体数目形态相似时难以分辨。,*黑麦(Secale cereale, 2n=14)染色体Giemsa C-带,*常规染色技术与显带技术的结果,人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片,荧光标记探针检测精子,3、生化标记贮藏蛋白、同工酶和等位酶,种子的贮藏蛋白： 同工酶： 等位酶： 优点：经济、方便、成本较低。 缺点：结构基因表达产物，对非结构基因无能为力；所检测位点只是基因组一部分；数量有限，有时受发育时期和环境影响。,同工酶与等位酶,同工酶(isozyme)：由一个以上基因座位编码的酶的不同形式。催化同一种化学反应，但其蛋白质本身
6、的分子结构组成有所不同的一组酶。 等位酶(allozyme)：由一个位点的不同等位基因编码的同种酶的不同类型。电泳可区分同一种酶（系统）的不同变化。,材料的采集,研磨和酶的提取,酶的保存,淀粉凝胶制备,电泳,凝胶切片,酶的组织化学染色,酶谱的记录与分析,数据分析,同工酶和等位酶分析的程序,夏腊梅,夏腊梅同工酶谱照片,4、分子标记,广义的分子标记(molecular marker)是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。蛋白质标记包括种子贮藏蛋白和同工酶（指由一个以上基因位点编码的酶的不同分子形式）及等位酶（指由同一基因位点的不同等位基因编码的酶的不同分子形式）。 狭义的分子标记概念只是指DN
7、A标记，而这个界定现在被广泛采纳，即现在通常所说的分子标记都是特指DNA标记。它能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段，它直接反映基因组DNA间的差异。,分子标记的特点,本质是以核苷酸序列作为标记，一般特点： （1）以DNA的形式表现，在生物体的各个组织、各个发育阶段均可检测到，不受季节、环境限制，不存在表达与否等问题。 （2）多态性高，自然界存在许多等位变异，无须人为创造。 （3）数量丰富，多态性遍及整个基因组。 （4）表现为“中性”，不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁。 （5）许多分子标记表现共显性，能鉴别纯合杂合基因型，提供完整的信息。,遗传标记（genetic
8、 marker）具有多型性 易于鉴别 与目标基因紧密连锁,性状标记色泽， 形态细胞学标记倒位，易位，G/N/C带生化标记同功酶分子标记RFLP、RAPD、SSR、AFLP、SNP ,基础-基因表达结果 表现型,DNA碱基 序列变异,三、分子标记的种类,第一类是以分子杂交为核心的分子标记技术，包括： 限制性片段长度多态性标记（Restriction fragment length polymorphism, 简称RFLP标记）； DNA指纹技术（DNA Fingerprinting）； 原位杂交（in situ hybridization）等。,第二类是以聚合酶链式反应（Polymerase c
9、hain reaction ,简称PCR反应）为核心的分子标记技术，包括 随机扩增多态性DNA标记（Random amplification polymorphism DNA, 简称RAPD标记）；简单序列重复标记（Simple sequence repeat, 简称SSR标记）或简单序列长度多态性（Simple sequence length polymorphism, 简称SSLP标记）； 扩展片段长度多态性标记（Amplified fragment length polymorphism, 简称AFLP标记）； 序标位（Sequence tagged sites, 简称STS标记）； 序
10、列特征化扩增区域（Sequence charactered amplified region, 简称SCAR标记）等。,第三类是一些新型的分子标记，如： 单核苷酸多态性（Single nuleotide polymorphism, 简称SNP标记）； 表达序列标签（Expressed sequences tags, 简称EST标记）等。,DNA分子标记的主要类型,依其所用的分子生物学技术大致可以分为：一类是以Southern杂交技术为核心的分子标记，（如RFLP），这类分子标记被称为第一代分子标记。一类是以PCR技术为核心的分子标记，（如STS、RAPD、AFLP、SSR）等，这类分子标记被称
11、为第二代分子标记。单核苷酸多态性（SNP）标记等被称为第三代分子标记 。它也是以以PCR技术为基础的分子标记技术。,第二节 限制性片段长度多态性 标记技术,该技术由Grodzicker等于1974年创立。1980年由 Botstein再次提出。1983年Soller和Beckman最先应用于品种鉴别和品系的纯度的测定。 自从人的RFLP图谱构建后，已经分别构建了果蝇、牛、大豆、小麦、水稻等多种生物的RFLP图谱。,一、RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)标记技术的原理,特定生物类型的基因组DNA经某一种限制性内切酶完全酶解后，会产生分子量
12、不同的同源等位片段，或称限制性等位片段。RFLP标记技术的基本原理就是通过电泳的方法分离和检测这些片段。 凡是可以引起酶解位点变异的突变，如点突变（新产生和去除酶切位点）和一段DNA的重新组织（如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化）等均可导致限制性等位片段的变化，从而产生RFLP。即：物种的基因组DNA在限制性内切酶作用下，产生相当多的大小不等的片段，用放射性同位素标记的DNA作探针，把与被标记DNA相关的片段检测出来，从而构建出多态性图谱。,EcoR酶切示意图,A sample : 5 AG-GAATTC-GAATTC-GAATTC-CG 3 3 TC-CTTAAG-CTTAAG-CTT
13、AAG-GC 5 AG-G AATTC-G AATTC-G AATTC-CG TC-CTTAA G-CTTAA G-CTTAA G-GC B simple : 5 AG-GAATTC-GAATCC-GAATTC-CG 3 3 TC-CTTAAG-CTTAGG-CTTAAG-GC 5 AG-G AATTC-GAATCC-G AATTC-CG TC-CTTAA G-CTTAGG-CTTAA G-CG,A,B,A,B,限制性内切酶位点,与放射性探针结合部位, 限制性内切酶酶切后； 电泳分离DNA片段； 转移至硝酸纤维素薄膜； 与放射性探针杂交， 分析阳性条带,RFLP的原理,DNA 限制性内切酶酶切
14、电泳 转移到硝酸纤维素滤膜同位素或非放射标记（如地高辛等）的探针杂交 胶片放射自显影，显示酶切片段大小,二、RFLP标记技术的操作步骤,DNA提取： 酶切：3-5 ug DNA，以20 U内切酶酶切6小时至过夜。 电泳：0.6-0.8%琼脂糖胶30-60 V电泳6小时至过夜。 染色观察：,DNA提取酶切电泳印迹,下列图谱哪个是合适的酶切结果？,变性： 脱嘌呤：0.25 mol/L中脱嘌呤，10 min。 变性：0.5 mol/L NaOH， 1.5 mol/L NaCl，45 min。 水冼； 中和：1 mol/Ltris-HCl (pH7.5) ，1.5 mol/L NaCl，30min。
15、印迹：用10 SSC ，进行Southern 印迹 冲洗：以2SSC 冼胶，风干,杂交洗脱,预杂交：将杂交膜放人预杂交液（水、5 HSB、Denhardt）中， 封好后置65温箱中振荡56小时。 杂交：预杂交液中加入标记好的marker和探针，放入杂交膜浸匀。封好杂交盒后，置65温箱中振荡过夜。 洗脱：将膜转入洗脱盒，加入洗脱液65 振荡洗脱两次（15min/次），吸干包好。,放射自显影数据分析,将洗脱好的杂交膜置于增感屏上, 于暗室中将 X-光片放于杂交膜上， 再放上另一张增感屏，装人暗袋，并用夹板夹好。置-80超低温冰箱中曝光过夜至10天左右。 使用磷屏仪，操作更方便。 用计算机处理得到的
16、数据信息,RFLP探针的来源,来源：cDNA探针与基因组DNA（gDNA）探针 cDNA探针: 保守性较强，探针检测的多态性频率较低。 gDNA探针: 检测的多态性频率较高，但不同种属特异性较强。 如：水稻RFLP探针可以在下列网页获取：玉米RFLP探针可以在下列网页获取： http:/www.maizegdb.org/probes. html,标记物：放射性和非放射性两种 放射性： 非放射性：生物素、地高辛素、荧光素 放射性同位素标记：灵敏度高，成本低但操作不便，标记效率不太稳定，寿命受半衰期限制 非放射性标记（地高辛、生物素、荧光素等）：安全，标记稳定，探针寿命较长但灵敏度较低，背景较高，成本高,
