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1、毕业论文开题报告,郭树攀,主要内容,前言,1,冬眠前中后酶活性的测定,2,冬眠阵与抗废用性肌萎缩,3,4,模拟冬眠阵大鼠与抗废 用性肌萎缩,前言,研究表明：冬眠动物历经数月冬眠期的肌肉废用后，其后肢肌肉仅有轻微的萎缩，慢肌中型和型肌纤维比例亦无明显变化，远不像非冬眠动物如大鼠那样出现严重的废用性肌萎缩和明显的慢肌向快肌的转化。.,但这一领域的研究还存在许多盲点与分歧，有关冬眠动物冬眠期抗废用性肌萎缩的机制研究鲜有涉及。因此，可以预见，这一领域的研究工作必将是富有趣味、充满挑战的开拓性工作。,冬眠前中后酶活性的测定,乳酸脱氢酶（糖酵解中的调节酶）,柠檬酸合酶活性测定（柠檬酸循环的限速酶）,酶活性
2、,我们在前期的研究中发现：黄鼠比目鱼肌肌重体重比在冬眠前后没有变化（P0.05）、 肌纤维比例在冬眠前中后均无变化（ P0.05 ），冬眠期间趾长伸肌肌重体重比、 肌纤维横截面积不仅没有下降，还有一定程度的增加，趾长伸肌型肌纤维比例明显增加（P0.01） ， 型肌纤维比例减少（P0.05）、 肌纤维比例在冬眠前中后均无变化（ P0.05 ），冬眠期间趾长伸肌肌重体重比、 肌纤维横截面积不仅没有下降，还有一定程度的增加，趾长伸肌型肌纤维比例明显增加， 型肌纤维比例减少。那么黄鼠在长达几个月的冬眠中如何维持新陈代谢的平衡又是怎样来抵抗骨胳肌萎缩? 冬眠阵在其中又起了怎样的作用呢？,本实验拟从冬眠阵
3、角度，研究其对骨骼肌的影响，运用SDS-PAGE对肌球蛋白重链(MHC) 型肌纤维之间的转化以及其亚型进行分析，探讨冬眠阵与黄鼠冬眠期抗废用性肌萎缩机制间的可能关系。以期为废用性肌萎缩的研究与治疗提供新的方向。,材料与方法：动物及分组 采用达乌尔黄鼠作为实验对象，由野外捕捉带回实验室饲养一段时间后进行实验。实验分为秋季肥育组、冬眠阵组和出眠组 ，每组8只。 用25%的乌拉塘（2g/kg）麻醉黄鼠，迅速取出后肢比目鱼肌和趾长伸肌，称重，置于液氮中迅速致冷，放入-70低温冰箱中保存直到使用。,样本处理：从-70摄氏度冰箱中取出肌肉样本,4 解冻，称取30 mg左右组织加入匀浆缓冲液(1:20) (
4、100mmol/L KCl 2mmol/L EDTA, 2mmol/L MgCl2,25mmol/L Tris-HCl pH=7.0,0.1mmol/L PMSF)匀浆,离心(12000r ,3min),取上清 ,BCA法测定匀浆的总蛋白浓度。加入上样缓冲液(20%甘油,4% SDS,0.2%溴酚蓝,2%-巯基乙醇,0.1mol/L Tris-HCl pH=6.8),使每个标本的蛋白浓度均为1g/l,100煮5m in,室温冷却备用。,实验方法骨骼肌肌球蛋白重链(MHC)采用低温SDS-PAGE(Bio-Rad公司的M IN I-PROTEIN II垂直电泳槽)进行分离: 4%浓缩胶(AcrB
5、is=501),含4mmol/L EDTA和0.4% SDS,70mmol/Tris-HCl pH= 6.8;8%分离胶(AcrBis=501),含100mmol/L glycine,0.4% SDS,40%甘油,200mmol/L Tris-HCl pH=8.8。 上槽电泳缓冲液组成(mmol/L):100Tris-base、150 glycine和0.1% SDS;下槽电泳缓冲液组成为(mmol/L):50 Tris-base、75 glycine 和 0.05% SDS。,在4环境下70V恒压持续电泳28h。电泳结束后,用拷马斯亮染法：染液（R-250 0.3%、甲醇 50%、冰醋酸 1
6、0%、双蒸水 40%） 2h;脱色液（甲醇 5%、冰醋酸 7%、蒸馏水 88%）2h (最好过夜)扫描(扫描分辨率为600dp,i256级灰度,其余参数均设置为工厂初始值,以TIFF格式保存图片),用Scion Image测量蛋白条带的光密度容积值,然后分别计算MHC I与所占百分比.,横拟冬眠阵与抗废用性肌萎缩,通过对黄鼠整个冬眠情况的统计得出，在黄鼠冬眠的1684天中，冬眠阵发生天数为1216天，占整个冬眠天数的72%，最短冬眠阵为1天，最长为36天，发生频率最高的为4天，冬眠阵阵中觉醒时间最短为1天，最长为12天，最高频率为2天。本实验拟从模拟冬眠阵角度去探讨其与抗废用性肌萎缩的可能关系
7、。,方法与材料：选取健康活泼大鼠作为实验对象，分为实验组和对照组，每组8只。 根据冬眠阵的高频天数为4天，阵间高频天数为2天的结果，我们采用大鼠尾部悬吊的方式模拟黄鼠在冬眠中冬眠阵的变化，具体来说：就是将大鼠尾部悬吊4天，然后将尾部下放，使使其后肢着地，休息2天，重复上述操作两到三个周期。同时用尾部一直悬吊的大鼠作为对照，比较其萎缩程度。,将大鼠运用25%（1g/kg）乌拉塘麻醉，迅速取出后肢比目鱼肌和趾长伸肌，称重，置于液氮中迅速致冷，放入-70低温冰箱中保存直到使用。 标本制作：从-70摄氏度冰箱中取出肌肉样本,称取30 mg左右组织，4 解冻加入匀浆缓冲液(1:20)(100mmol/L KCl 2mmol/L EDTA, 2mmol/L MgCl2,25mmol/L Tris-HCl pH=7.0,0.1mmol/L PMSF)匀浆,离心(12000r ,3min),取上清 ,BCA法测定匀浆的总蛋白浓度。,加入上样缓冲液(20%甘油,4% SDS,0.2%溴酚蓝,2%-巯基乙醇,0.1mol/L Tris-HCl pH=6.8),使每个标本的蛋白浓度均为1g/l,100煮5m in,室温冷却备用。 实验方法：采用低温SDS-PAGE对比目鱼肌球蛋白重链(MHC)进行分离。操作步骤同上。,Thank You !,
