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1、资源微生物技术,第三章 微生物技术基本试验,第三章 微生物技术基本试验,一、培养基的配制 二、灭菌方法 三、接种方法 四、细菌总数目的显微镜计数方法 五、细菌的生长曲线 六、菌体的红外光谱测定样品制备方法 七、菌体的扫描电镜样品制备方法 八、菌体表面Zeta电位的测试方法,一、培养基的配制,1、氧化亚铁硫杆菌，一般都用西尔弗门(Silverman)培养基进行培养，这种培养基的配方为：溶液I： 3.0 g (NH4)2SO40.1 g KCl0.5 g K2HPO40.5 g MgSO47H2O0.01 g Ca(NO3)2700 ml 蒸馏水,西尔弗门(Silverman)培养基配制方法,溶液
2、II：44.2 g FeSO47H2O 300 ml 蒸馏水， 1 ml 5mol/L 硫酸溶液。溶液I在0.1 MPa下灭菌，溶液在0.05 MPa下灭菌，在使用前把两种已灭过菌的溶液混合。因这种培养基中Fe2+的含量为9 g/L，所以又称为9K培养基。,利瑟恩(Leathen)培养基,纯种的T.f菌： 溶液I：0.15 g/L (NH4)2SO4,0.05 g/L KCl,0.10 g/L KH2PO4,0.50 g/L MgSO4.7H2O,0.01 g/L Ca(NO3)2.4H2O1L H2O0.1 MPa下灭菌30min,溶液II ：10mL 10 Fe2SO4.7H2O,pH3.
3、50.05 MPa下灭菌30min,在使用前把两种已灭过菌的溶液混合，pH调至3.5。,2号培养基的配制方法,2、草分枝杆菌与诺卡氏菌的培养基为2号培养基，其培养基组成为：Beef grease 牛肉膏 3 g，Peptone 蛋白胨 10 g，Sodium chloride 氯化钠 5 g，Distilled water 蒸馏水 1 L，（ Agar 琼脂1520 g ）pH=7.0-7.2。,液体培养基的配制,放入灭菌锅前的液体培养基,所配制的培养基是液态的，其中的成分基本上溶于水，没有明显的固形物，液体培养基营养成分分布均匀，易于控制微生物的生长代谢状态。,固体培养基的配制,固体培养基,
4、灭菌后摆斜面,在液体培养基中加入适量的凝固剂（1.5-3）即成固体培养基。常用作凝固剂的物质有琼脂、明胶、硅胶等，以琼脂最为常用。固体培养基在实际中用得十分广泛。在实验室中，它被用作微生物的分离、鉴定、检验杂菌、计数、保藏、生物测定等。,把少量的凝固剂加入到液体培养基中，就制成了半固体培养基。以琼脂为例，它的用量在0.20.5%之间。这种培养基有时可用来观察微生物的动力，有时用来保藏菌种。,半固体培养基的配制,培养基的配制,水：配制培养基应使用蒸馏水或相同质量的水，目的是排除抑制或影响微生物生长的物质。 称量和复水：称量所需的脱水培养基（注意缓慢操作，必要时佩戴口罩或在通风橱中操作，以防吸入含
5、有毒物质的培养基粉末），先加入少量的水，充分混合（注意避免培养基结块），然后再加水至所需的量。 溶解和分装：脱水培养基加水后适当加热，并不停搅拌使其快速溶解，必要时，重新溶解。含琼脂的培养基在加热前应先浸泡几分钟。由多种成分制备的培养基应将不同成分分别加入适量的水中，并充分溶解，然后再加水至所需的量。,培养基的配制,pH的测定和调整：用酸度计测pH，必要时进行调整。一般使用浓度为1mol/L氢氧化钠溶液或盐酸溶液进行培养基pH的调整。值得注意的是，商品化的培养基在高压灭菌前后的pH可能变化很大，但使用质量好的蒸馏水或去离子水配制时，灭菌前并不需要调节pH。 分装：将配制好的培养基分装到适当的容
6、器中，应按使用的目的和要求，分装于试管、烧瓶等适当容器内，分装量不得超过容器装盛量的2/3。容器口可用垫有防湿纸的棉塞封堵，制作的棉塞应紧贴管壁，不留缝隙，以防外界微生物沿缝隙侵入，棉塞不宜过紧或过松，塞好后以手提棉塞，试管不下落为准。棉塞的2/3在试管内，1/3在试管外。,二、灭菌方法,干热灭菌法 火焰灭菌法干燥加热空气灭菌法 高温灭菌 巴氏消毒法常压下 煮沸消毒法湿热灭菌法 间歇灭菌法常规加压灭菌法加压下 (高压蒸汽灭菌法)连续加压灭菌法,二、灭菌方法,干热灭菌法,1.焚烧：是一种彻底的灭菌方法，但仅适用于废弃物品或尸体等。 2.烧灼：直接用火焰灭菌，适用于微生物学实验室的接种环、试管口等
7、的灭菌。 3.干烤：鼓风干燥箱灭菌。一般加热至160170经2小时。适用于高温下不变质、不蒸发的物品， 如玻璃器皿、瓷器等。,二、灭菌方法,湿热灭菌法,1.煮沸法：1个大气压下，煮沸的水温为100，一般细菌繁殖体煮沸510分钟即被杀死。细菌芽胞常需煮沸1小时，才被杀死。水中加入2%碳酸钠，可提高沸点达105，促进细菌芽胞的杀灭。 2.巴氏消毒法：用较低温度杀灭液体中的病原菌、同时又不影响消毒物品的营养成分及香味的消毒方法。加热61.162.8半小时即可，常用于牛奶和酒类等的消毒。,二、灭菌方法,湿热灭菌法,3. 间歇灭菌法：将待灭菌的物品100加热1530分钟，杀死其中的细菌繁殖体，然后将物品
8、置于37温箱中过夜使芽胞发育成繁殖体，次日再通过流通蒸汽加热，如此连续三次，可将所有细菌繁殖体和芽胞全部杀死。针对牛奶、糖等在100以上有效成分易被破坏的产品进行灭菌。,4.高压蒸汽灭菌法：是灭菌效果最好、目前应用最广的灭菌方法。方法是在一密闭蒸锅高压蒸汽灭菌器内进行的。通常采用纯饱和蒸汽压为121.5kPa，温度达125,维持2030分钟，可杀死包括细菌芽胞在内的所有微生物。适用于各种耐热、体积大的培养基的灭菌，也适用于玻璃器皿、工作服、耐高温塑料用品等物品的灭菌。,二、灭菌方法,湿热灭菌法,二、灭菌方法,高压蒸汽灭菌法： 1、用途 （1）无菌水的制备 （2）玻璃器皿的灭菌（滴管、移液管、锥
9、形瓶、烧杯） （3）培养基的灭菌2、121.5 kPa 下灭菌 2030分钟。,试管或锥形瓶口的密封方法,不正确的棉塞,试管帽,正确的棉塞,棉塞的叠法,棉塞的叠法,高压蒸汽灭菌锅,电加热圈,水位线,压力表,安全阀,放气阀,灭菌器,高压蒸汽灭菌锅使用注意事项,首先将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。 放回灭菌桶，并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤，以免防碍蒸汽流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。 加盖，打开放气阀。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。 灭菌所需时间到后，让灭菌锅
10、内温度自然下降，当压力表的压力降至0时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。如果压力未降到0时，打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染。,高压蒸汽灭菌步骤,开始加热时， 打开放气阀； 加热至放气阀冒出蒸汽； 5分钟后，关上放气阀； 开始计时，灭菌30分钟； 关上电源开关，自然冷却； 至压力表指针为零，打开放气阀； 打开锅盖6个密封旋钮。,微孔滤膜过滤法,滤膜孔径0.22m,步骤： 1、接种前将无菌操作台、接种环、培养基紫外线灭菌30分钟（摆好了斜面的试管装固体培养基、表面皿装的固体培养基、锥形瓶装的液体
11、培养基）,三、接种方法,接种环,无菌操作台,2、点燃酒精灯；3、将接种环的钨丝在酒精灯火焰上加热变红（灭菌），4、用接种环在菌种保存试管中轻轻刮少许细菌，5、快速将带有细菌的接种环浸入液体培养基中；或在固体培养基中画“之”字形或“井”字形。见下图,三、接种方法,倾注平板,菌落培养,接种和分离工具 1 .接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀,挑菌落工具,移接斜面时常用的接种方法：划线接种点接种穿刺接种涂布接种液体接种注射接种,斜面接种时的无菌操作 (1)接种灭菌 (2)开启棉塞 (3)管口灭菌 (4)挑起菌苔 (5)接种 (6)塞好棉塞,四、细菌
12、总数目的显微镜计数方法,特制的载玻片正面图,特制的载玻片侧面图,步骤： 1、将细菌悬液用蒸馏水稀释A倍； 2、将配好的细菌稀释液滴入在玻片上； 3、盖好盖玻片。,四、细菌总数目的显微镜计数方法,n1,四、细菌总数目的显微镜计数方法,n2,四、细菌总数目的显微镜计数方法,n3,四、细菌总数目的显微镜计数方法,n4,四、细菌总数目的显微镜计数方法,N1=(n1+n2+n3+n4)/4,N2,N3,N4,N5,载玻片上刻有的大方 格的尺寸： 边长1.0 mm, 盖上盖 玻片，则其间高度为 0.1 mm。 因此，每个大方格的 体积为0.1 立方毫米。,四、细菌总数目的显微镜计数方法,计算步骤 1、 n
13、 （n1 + n2 + n3 + n4 ）42、 N1 16n3、 N （N1 N2 N3 N4 N5）54、 一个大方格（0.1立方毫米）中细菌的总数 N255、 1 mL 1 立方厘米 1000 立方毫米； 细菌液稀释了A倍。6、 1 mL 溶液中总的细菌数为(个) 100025NA0.1,原理：平板菌落计数是将待测样品经适当稀释后，其中的微生物充分分散成单个细胞，去一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，一个菌落就可以看成是由一个细胞繁殖而成的。,平板菌落计数,操作步骤： 无菌平皿编号制备菌悬液 倾注平板 培养(48h) 计数,注意事项：倒平板时要注意控制培养基的温度。稀释操作时，要尽量
14、减少样品稀释误差，而且每个稀释度的菌液应各用一支无菌吸管。为使菌落能在平板上均匀分布，样品液加入平皿后，应尽快倾注培养基并旋转混匀。,五、细菌的生长曲线,在HZQ-C空气浴震荡器中、在28C、160 r/min的震荡频率下培养细菌；每隔24 h取出100 mL菌悬浮液，采用转速为16000 r/min TGL16台式高速离心机离心分离10 min后测细菌的湿重。然后绘制细菌生长时间（h）与细菌生长量（每100 mL菌液中菌体湿重量）曲线。,空气浴震荡器,草分枝杆菌的生长曲线,六、菌体的红外光谱测定样品制备方法,操作步骤：1、离心分离菌体； 2、用蒸馏水洗涤； 3、在50 C的恒温烘箱中干燥；
15、4、取干燥的菌体与光谱纯溴化钾一起在玛瑙研体中研磨； 5、将适量的粉末放入压片机中，进行压片； 6、用红外光谱仪（510P FTIR型）对样品进行分析测定。,*溴化钾在红外区无吸收*,红外光谱的基本概念,* 红外光谱是一种吸收光谱。在4000400 cm1的红外线照射下，有机物分子选择性地吸收其中某些频率后，用红外光谱仪记录所形成的吸收谱带，就称为红外光谱。* 红外光谱的横坐标是波数（cm1）或频率；纵坐标是光线的透过率（T），或摩尔吸收系数来表示：1/（CL） * lg（I0/I） C浓度 L比色池厚度 I透过光的强度 I0入射光的强度,为什么不同有机基团会产生不同的红外光谱？, -OH、-SH、-NH等化学键存在振动。 振动形式有：伸缩振动、弯曲振动。弯曲振动包括：面内弯曲（剪式振动 、平面摇摆振动）面外弯曲（ 非平面摇摆振动、扭曲振动）伸缩振动包括： 对称伸缩振动、不对称伸缩振动,
