显微镜的结构使用及维护与植物制片技术1

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1、显微镜的结构使用与维护及 植物制片技术,Company Logo,基础知识,一、显微镜的结构使用及维护 显微镜的光学原理 显微镜的几个基本概念 显微镜的结构 显微镜的使用 显微镜的维护,基础知识,要知道的几个重要的分辨率:,人眼：0.2mm/250mm毫米 光学显微镜：0.2um微米 电子显微镜：0.2nm纳米,基础知识,显微镜的发展,1.1 人眼：人眼观察物体的能力是有限的。一般的情况下，在25cm的明视距离内，人眼只能分辨相距0.1-0.2mm的两个物体。也就是说，当两个物体相距不到0.1mm的时候，人眼就会把它们看成是一个物体了。这个极限便称为人眼的分辨本领。 1.2 放大镜：约在四百年

2、前眼镜片工匠们开始磨制放大镜。当时的放大镜的放大倍数只有35x,基础知识,1.3 显微镜的发展：1590年，荷兰和意大利的眼镜制造者造出类似显微镜的放大仪器。16731677年期间，列文胡克制成单组元放大镜式的高倍显微镜 19世纪70年代，德国人阿贝奠定了显微镜成像的古典理论基础。 1850年出现了偏光显微术；1893年出现了干涉显微术；1935年荷兰物理学家泽尔尼克创造了相衬显微术,基础知识,基础知识,列文虎克和他的显微镜（约1680）,基础知识,显微镜的使用,基础知识,显微镜概述显微镜是观察细胞的主要工具。根据光源不同，可分为光学显微镜和电子显微镜两大类。前者以可见光（紫外线显微镜以紫外光

3、）为光源，后者则以电子束为光源。 1.光学显微镜普通生物显微镜由3部分构成： 照明系统：包括光源和聚光器。 光学放大系统：由物镜和目镜组成，是显微镜的主体。 机械装置：用于固定材料和观察方便，包括镜台(载物台) 、调节器和物镜转换器(旋转器)等。,光学显微镜基本结构： 1. 照明灯(Lamp) 2. 聚光器(Condenser) 3. 载物台和切片夹(Mechanical stage and specimen retainer) 4. 推进器(Mechanical stage adjustment knob) 5. 物镜(Objectives) 6. 粗细螺旋(Course and fine

4、focus knob) 7. 目镜(Oculars) 8. 照相机等接口(Connection to camera, etc.),基础知识,显微镜的几个基本概念： 1、光源：能发射光波的物体。可见光频率范围：7.51014 - 3.91014 Hz。真空中对应的波长范围：390nm 760nm相应光色：紫、蓝、青、绿、黄、橙、红,基础知识,2、 数值孔径 数值孔径又叫镜口率。它是指所观察的物体与镜头间介质的折射率n与物镜镜口角一半的正弦值的乘积。用N.A或A.来表示。 即：N.A.nsin（/2） 所谓镜口角是指被观察点射入物镜前 透镜的边缘光线之间的夹角。 数值孔径是物镜与聚光镜的重要参数，

5、 一般希望它越大越好。 一是增大镜口角，可以让标本与物体尽量靠近。但无论怎样靠近，总是小于180。这样，sin（/2）也小于。而空气的折射率n1。因此，干燥系物镜的数值孔径nsin（/2）总是小于1，一般在0.040.95之间。 二是增大物镜与标本之间的折射率，可在物镜与标本之间加入折射率较大的介质。如香柏油的折射率n1.515，使用香柏油为介质时，可使数值孔径达到1.2以上。,物镜数值孔径,基础知识,3、分辨率 分辨率是指显微镜分辨被检物体细微结构的能力。它与分辨距离成反比。 分辨距离是指能被分辨开的两物点间的最小距离。分辨距离越小，显微镜的分辨率越高。 如果两物点间的距离小于分辨距离，就会

6、把两点误看成一点，无法看清其结构。显微镜的分辨率是由物镜决定的。目镜只起放大作用，不能增加显微镜的分辨率。 在普通中心照明的情况下，物镜的分辨距离由下式决定。 0.61*/N.A. 式中：表示分辨距离, 单位是微米，表示照明光线的波长，单位也是微米。 在可见光中，亮度最大而且对人眼最敏感的波长为0.55m，物镜最大的N. A.为1.4。代入上式可得近似为0.2m。即，使用普通光学显微镜，在中心照明的情况下，分辨距离的极限为0.2m。也就是说，小于0.2m的两物体，普通光学显微镜无法区分。,基础知识,4、 放大率 显微镜的放大率等于物镜的放大率和目镜的放大率的乘积。从原理上讲，放大率可以做的非常

7、大。但是，如果标本的细节不能被物镜分辨开来，放大的再大，也毫无意义。理论上可以推导出来，显微镜最合适的放大率（称为有效放大率，用有效表示）是在物镜的数值孔径的5001000倍之间。即 500N.A.有效1000N.A. 在有效放大率范围内，眼睛可以长时间观察而不易疲劳。如果放大率低于500 N.A.，观察起来就很吃力。如果高于1000N.A.，则会使像质变坏，甚至造成不真实的像。因此，超过1000N.A.的放大率称为无效放大率。,基础知识,在物镜上，有镜口率(N.A.)的标志，它反应该镜头分辨力的大小，其数字越大，表示分辨率越高，各物镜的镜口率如下表： 物镜 镜口率(N.A.) 工作距离(mm

8、) 10 0.25 5.4040 0.65 0.39100 1.30 0.11显微镜的总放大倍数等于目镜和物镜放大倍数的乘积，公式为: M = K1xK2 。,基础知识,5、工作距离 工作距离是指显微镜调焦后，在使用标准盖玻片和标准机械筒长的情况下，物镜的下表面至盖玻片上表面之间的距离。物镜的放大率越高，工作距离越短。一般10倍以下的低倍物镜，工作距离为57mm，而100倍的油镜，其工作距离只有0.19mm左右。,基础知识,6、焦点深度 当显微镜调焦于标本中某一平面后，不仅这一物平面可以看清楚，而且和它相连的上下两个物平面也能同时看清楚。这上下两个物平面之间的距离叫做焦点深度，简称焦深。 显微

9、镜的焦深是很小的，而且数值孔径越大、总放大率越大，焦深越小。例如，使用N.A.为1.25/100倍的油镜、12.5倍的目镜观察时，焦深只有0.27m。这就是说，调焦后一次只看清楚0.27m厚的一个薄层。而普通标本一般都有几个微米厚。要想看完整个标本，需要使用显微镜的微调机构，自上而下分层观察。,基础知识,焦点深度,7、视场 视场又叫视野。是指显微镜一次能够看到的被检物体的范围。显微镜的视场由物镜的视场和目镜的视场共同决定的。普通物镜的视场小于20mm，大的可达40mm以上。普通10倍目镜的视场为14mm，大的可达24mm以上。物镜与目镜一旦设计好后，其视场便固定了。视场的大小与显微镜的总放大率

10、成反比。总放大率越大，视场越小。解决的办法是利用移动器，使标本的各部分依次进入视场，轮流观察。,基础知识,8、镜像亮度 镜像亮度是指显微镜中所看到的物像的亮暗程度。为了便于观察，我们希望所成的像亮一些。在外部光线不变的情况下，镜像亮度与数值孔径的平方成正比，而与总放大率的平方成反比。要想使镜像亮度大些，应使用大数值孔径的物镜，配以低放大率的目镜。例如，在物镜相同的情况下，使用5倍的目镜与使用10倍的目镜相比，其镜像亮度要大4倍。 使用电光源的显微镜，其镜像亮度可以通过调节照明灯的亮度来控制。,基础知识,9、清晰度 显微镜成像的清晰度取决于其光学系统，尤其是物镜的光学性能。 影响清晰度的主要原因

11、有以下5点： （1）所使用的盖玻片的厚度不合格 （2）调焦没有调到理想位置 （3）总放大率用得过大 （4）油镜的镜头没有擦干净 （5）镜片生霉等。,物镜 (objective)物镜是光学显微镜成像系统中决定其分辨率或叫分辨本领的最关键部件。物镜是由若干个透镜组合而成的一个透镜组，组合使用的目的是为了克服单个透镜的成像缺陷，提高物镜的光学质量。显微镜的放大作用主要取决于物镜，物镜质量的好坏直接影响显微镜映像质量，它是决定显微镜的分辨率和成像清晰程度的主要部件。,基础知识,物镜类型： (1) 按显微镜镜筒长度 (以mm计):透射光用160筒,0.17mm厚或更厚的盖玻片;反射光用190镜筒,不带盖

12、玻片;透射光与反射光用镜筒,筒长无限大 (2)按浸法特征:非浸式(干式)、浸式(油浸、水浸、甘油浸及其它浸法)。 (3) 按光学装置:透射式、反射式以及折反射式 (4)按数值孔径和放大倍数:低倍(NA0.2与10X),中倍(NA0.65与40X),高倍(NA0.65与40X)。 (5)按校正象差的情况不同,通常分为消色差物镜,半复消色差物镜,复消色差物镜,平视场消色差物镜,平视场复消色差物镜和单色物镜。,基础知识,物镜结构,目镜目镜的作用是把物镜放大的实象再放大一级，并把物象映入观察者的眼中，实质上目镜就是一个放大镜。显微镜的分辨率能力是由物镜的数值孔径所决定的，而目镜只是起放大作用。对于物镜

13、不能分辨出的结构。目镜通常由若干个透镜组合而成，具有较大的视场和视角放大率,基础知识,聚光镜 用于照明物体并保证物镜具有一定数值孔径的会聚透镜。聚光镜装在载物台的下方。小型的显微镜往往无聚光镜，在使用数值孔径0.40以上的物镜时，则必须具有聚光镜。聚光镜不仅可以弥补光量的不足和适当改变从光源射来的光的性质，而且将光线聚焦于被检物体上，以得到最好的照明效果。,基础知识,聚光镜光栏 所谓光栏，从广义的角度可指一切限制入射光束截面的框孔都可认为光栏。聚光镜光栏作用（1）改变聚光镜的数值孔径以便与物镜的数值孔径相匹配，可调整图象的分辨率和反差。（2）辅助调整亮度。,聚光器数值孔径,孔径光栏开度与图象,

14、显微镜的使用 观察前的准备工作 (1)观察者要养成显微镜镜检的工作习惯，观察时要双眼同时睁开，一边观察一边进行记录或描绘。(2)观察时所用的材料、药品和各种器具要预先准备好。(3)显微镜在使用之前应检查一下它的各个部件是否完整和正常，并对载物台、目镜、物镜以及聚光器上端透镜进行必要的清洁工作。,瞳 距 调 节,2. 显微镜的调节,屈 光 度 调 节,调节,粗细螺旋调节旋钮,基础知识,观察操作 低、高倍镜的使用: 先把低倍的物镜用粗调焦螺旋下降至离盖玻片0.5cm处，然后一边观察视野一边上升物镜，直至看到图像，再将标本移到视野中心，用细调焦螺旋把物镜调至最清晰处，若要用高倍镜观察时，把所要进一步

15、放大观察的部位移至视野中央，直接顺时针转换成高倍物镜，然后用细调焦螺旋调焦，至看清物像。,油镜的操作方法:将高倍镜观察到的目标移动至视野中央 将高倍镜镜头挪开，于载玻片上滴一滴香柏油 将油镜镜头移动至视野中央，让油镜镜头浸入香柏油（至油晕不再扩大为止） 用微调焦螺旋调节至清晰 注意：油镜的操作需要较强的光线，故需将光线调至最强。 油镜用后处理： 第一遍：用擦镜纸拭去镜头上的镜油 第二遍：用擦镜纸蘸少许二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦去镜头上残留的油迹 第三遍：再用干净的擦镜纸擦去残留的二甲苯。,光线通过几种介质的折射率（n）比较：,倒置显微镜倒置显微镜中最常用的观察方法就是相差。由于这种方法不要求

16、染色，是观察活细胞和微生物的理想方法。 这种方法提供带有自然背景色的、高对比度的、高清晰度的图像。倒置显微镜与正置显微镜的主要区别在于物镜 位于载物台下方，这样有利于观察时在上方对样品进行一些实时操作。,倒置显微镜操作过程基本与双筒的正置显微镜相似，需注意以下几点： 观察时可调节铰链式双目目镜至舒适的位置。 组织培养液或水溅到载物台上、物镜上或显微镜镜架上可能会损伤设备。如果溅上后，应该立即从墙上插座拔下电源线，擦去溅出液或水。 一定要轻柔转动光强调节钮，不要试图将旋钮转过终点位置。使用后一定要先将灯的强度调至最小再关电源。 使用后要旋转三孔转换器，使物镜镜片置于载物台下侧，防止灰尘的沉降。,