《《分子生物学常用技术在中医药研究中的应用》实验课01绪论》由会员分享，可在线阅读，更多相关《《分子生物学常用技术在中医药研究中的应用》实验课01绪论（44页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1,分子生物学技术在 中医药研究中的应用上海中医药大学,2,绪 论,3,一、中医药实验研究为什么要采用分子生物学技术1一些不同的认识 （1）中医是宏观的，讲整体的。微观分子生物学是无法研究中医的、发展中医的。 （2）担心采用现代技术研究中医，中医会被西医吃掉。 （3）中医是经验医学，西医是实验医学。中医的灵魂在临床，不在实验。 于是一些人对该技术格格不入，学不进去。 这些认识对不对呢？是否准确地了解中医药学术发展史，是否了解分子生物学及其技术发展的背景和进展，是否了解当今医学研究发展的现状？回答是否定的。,4,回顾历史，教训是很多的。 中医药一度比较发达的解剖、麻醉、化学药物合成，这些有的早已
2、丧失；例如宋以来的人痘人工免疫、明以来的疠气学说、当代的水蛭素等，优势已经丧失，或还在不断地丧失！ 医学存在客观上存在的竞争。面对这样的竞争，怎么办？是固步自封，还是积极进取？中医要不要发展、要不要创新？如何去发展、去创新？一边是深深的忧患意识，一边却是动嘴不动手的妄加评判。我们不赞成这样的做法。,5,因此，本课程的目的要解决3个问题：（1）该技术能不能用来研究中医，即 能否用？（2）如何用该技术来研究中医，即 如何用？（3）采用该技术研究中医的目的，即 为何用？,6,2中医药实验研究采用分子生物学技术的必要性40年来，中医现代化实验研究从无到有，经历了： 临床验证性研究 初步的机理研究 以及
3、全方位展开的深入的机理研究和探索，等3个阶段，研究初步实现了与世界医学实验研究的接轨。在研究中大家逐渐认识到，加强分子生物学研究中医药是新时期中医药发展的迫切需要！这是因为：,7,（1）振兴中医的重要机遇 分子生物学、细胞生物学以其实验条件便于控制、实验稳定、重复性好、实验周期短、仪器试剂（包括各类试剂盒）发展快，手段丰富、国际研究普遍（使新方法、新技术层出不穷）、研究积累快、参考文献丰富，可以观察人体不同组织的细胞、分子（这又强于动物实验），给应用该技术创造了绝佳的条件。 以往所开展的研究，业已揭示和开拓出生命科学广大的前沿领域。 由于分子生物学技术发展快、传播广，给国内外、中西医创造了同等
4、的发展和应用机会，使中、西医有可能站到同一起跑线上。因此，抓住这个千载难逢的机会，充分利用它、驾御它，必将给中医学研究与发展注入强大的生命。,8,（2）保持中医药优势的需要 几千年来，中医在运用天然药物方面积累了丰富的经验。其中一些天然动植物药物的粗制品，比如水蛭素、蛇毒抗栓酶类制剂已经成为我国传统医药产业的一些产品。但是当国外采用了分子生物学技术和生物工程，生产出水蛭素、类凝血酶素，既降低了成本，又提高了质量及稳定性。反销我国和国际市场，对我国传统医药产业形成了巨大冲击与竞争。有识之士开始呼吁不能坐视祖国医学优秀遗产的优势失去，主张抓紧采用先进、高效的技术，包括分子生物学研究天然中药的有效成
5、分，开发新药，不然势将失去优势。,9,通过几十年的研究，中药所面临的问题已经暴露得十分清楚，比如：天然中药材的质量稳定性不易控制、占用耕地；中药有效成分和若干有效成分最佳组合有待研究与探索；中药有效成分产率、得率有待提高；以及中药服用安全、方便有待发展，等等。这些研发工作，均有赖于大量的基础研究与发展。 当代中药及其产业的发展，有赖于广泛扎实的基础研究，不然，没有强大的基础研究与发展的积累和支撑，中药的研发将成为无本之木。 而已有的研究表明，在所有研究手段中，分子生物学方法与技术是十分重要、有效的手段。,10,（3）继承和发展中医基础理论的需要 中医药的作用发挥，脏腑病机的变化、不同治法（具体
6、落实到中药复方及其有效成分，针灸、推拿等治疗方法）的作用环节和最终作用的发挥，均落实到人体基因转录与表达的调控。 已有的研究表明，中医药的取效，往往是通过对基因的转录与表达调控实现的。甚至，一些基因缺失或突变所引起的疾病，中医药通过对其它有关基因的转录调控，进行补偿，可以达到治疗疾病的目的。 因此，深入研究对于阐明中医药的作用机制、阐明生命的调控原理，均具有重要的科学意义。作为对中医学优秀遗产的继承和发展，这部分的研究具有广阔的天地，是中医基础理论研究的重头。,11,另一方面，还应该看到，临床研究局限性与困难日益明显。主要表现在： 1）医学伦理限制。 2）医从性差。病员顾虑，研究人员能力等限制
7、。 3）研究成本高。限于种种困难，证治的动态演变观察研究难以深入；临床证治的干扰因素多且复杂，严重影响到证治疗效的观察、评估；实验室检查和治疗费用昂贵。 4）难以开展机制研究。临床研究难以开展创伤性检查，细胞、分子水平的调控研究难以进行。 采用分子生物学、细胞生物学技术能在很大程度上弥补其不足。,12, 结论：（1）在中医药研究中应用分子生物学技术，目的在于揭示中医理论和中医药作用的分子及其调控机制、探索新的生命现象及其调控机制、丰富中医药理论和生命科学知识，并为中医药诊疗水平的提高、中医药生物产业的发展奠定基础。（2）当代中医药研究和发展，应该针对当前医学需求和发展，并深入生命科学的前沿，有
8、所发现、有所发明、有所贡献。,13,3分子生物学的发展历程1871年，首次发现DNA（鲑精DNA）。 1943年，证明DNA为遗传分子，而不是蛋白（1944，O T Avery）敏锐的洞察力、对新现象的捕捉能力。 1953年，DNA双螺旋模型提出（J D Watson（美）和F H C Crick（英），1962年或诺贝尔生理学、医学奖）。从而为分子生物学这一学科奠基敏锐的洞察力、多学科知识的综合运用。 1961年，合成mRNA，破译第一个遗传密码（M W Nirenberg（美），1968年获诺贝尔生理学、医学奖）基础研究的创新，与推动人类文明的进步。 （以上被称为理论上的三大发现）,14,
9、 1970年，分离出第一个限制性内切酶（W Arber（瑞士），1978年获诺贝尔医学奖） 1970年，Baltimore和Temin发现了逆转录酶长期的基础研究积累迎来了突飞猛进的高潮。 1973年，Cohen把质粒作为基因工程的载体使用基础研究向应用研究的拓展。 （以上被称为生物工程技术的的三大发明。）有人统计，自1957-1982的25年间，从事核酸研究而获得诺贝尔奖的有29位！,15,3个事例： （1）1976年，重组DNA成功（H Boyer（美）和S N Colen（美？），1981年获诺贝尔化学奖）勇敢的科学精神。 （2）1982年，美国一制药公司在2000升发酵液中提取出100
10、克精制胰岛素！相当于从1600磅动物胰腺中的提取量效率、成本、质量、竞争。 （3）荷兰最早把分子生物学产品“猪牛痢疾疫苗”投放市场，比以上美国的胰岛素早半年后来居上。,16,二、分子生物学技术在中医药研究中的实例但是，如何运用分子生物学方法技术来研究中医，如何把两者紧密结合起来，这些技术对中医学术发展有什么帮助，如何找到最佳的切入点，等等。诸如此类的问题、困惑还萦绕在许多中医工作者和学生的脑海中。 归结起来，如何用、怎样用的问题并没有得到普遍地解决。为此，我们先以中医药延缓衰老的理论和研究发展为例，看看分子生物学在中医研究中的应用。,17,早在黄帝内经时代，中医学对人体的衰老和防治已经积累了丰
11、富的经验，并在理论上把衰老归结为五脏精气虚，最终导致肾气虚、天癸竭，生殖系统衰老而丧失生殖能力。此后，预防和延缓衰老主要从补五脏、补肾入手。但是补有不同的补法，各有家传不同、门户之异，就中药复方而言，仅补肾便有平补、温补、凉补、阴阳并补、填精等区别，还有滋阴泻火、温肾祛寒、数法兼用，等等。用药讲究君臣佐使、轻重缓急，即便同一治法，用药还会有很大的区别。发展到了唐宋，已经积累起大大小小、许许多多的延缓衰老的单方和复方，面对如此众多的处方，临床应该如何选择，有没有最好的？,18,金元后期，朱丹溪提出阳常有余，阴常不足，治疗主张滋阴泻火，留有著名的大补阴丸。在明代李时珍本草纲目“黄柏”条下，也记载有
12、长期服用单味黄柏以延缓衰老的论述。然而，明末的张介宾则极力反对，认为阳气是人体的大宝，不应该采用寒性药物大肆克伐，而力主温补。就这样，中医界寒温之争持续了几百年。几百年来，临床上有人禀承丹溪学说，也有人推衷景岳学说，没有定论。 现代临床实验研究方法引入中医临床观察后，发现同样是老年人，激素水平、神经递质水平存在显著差别，这些递质、激素在部分人群当中可以长期维持在一个较高的水平，而部分人群随着衰老则明显下降。其中，这些年大量实验研究所观察到的与寒证、热证有明显关系的儿茶酚胺类递质在老年人中波动就很大。,19,我们采用动物实验研究中药二仙汤（仙茅、淫羊藿、巴戟天、当归、知母、黄柏）及其寒温两个拆方
13、的作用机理时发现，温肾药（仙茅、淫羊藿、巴戟天、当归）对老年和去势大鼠下丘脑-垂体-性腺（去势动物观察肾上腺）轴兴奋作用突出，而滋阴泻火药（知母、黄柏）对这些轴的延缓衰老和保护作用突出，部分揭示出寒、温治法的差别。联系到临床研究结果，显然，对那些激素、神经递质水平高、热象明显的老年人，补肾以偏重于滋阴泻火为妥；而对于那些激素、神经递质水平低、寒象明显的老年人，补肾以偏重于温肾壮阳为妥。以上中医基础理论研究丰富了中医学延缓衰老的理论和方法，对临床上延缓衰老的辨证论治起到了积极的指导作用。,20,以上中药复方及拆方实验涉及到神经-内分泌网络，该网络的示意图如下：大脑其他神经 核团、嗅球等下丘脑 G
14、nRH 垂体 LH、FSH 性腺 T、E2,21,生物医学研究表明，生殖的发生和衰老与下丘脑-垂体-性腺轴的发育成熟和衰老有关。在下丘脑水平，促性腺激素释放激素（GnRH）释放的一定数量和频率对于保持正常生殖能力是十分必要的。GnRH是由下丘脑位于弓状核和视前区的GnRH神经元所分泌。 为了进一步了解二仙汤的作用机制，我们采用了分子生物学实验技术观察了二仙汤对老年大鼠下丘脑、垂体GnRH含量的变化。研究发现，24月龄老年大鼠下丘脑GnRH mRNA含量（Northern blot）较5月龄青年大鼠下降、垂体GnRH（下丘脑合成的GnRH通过垂体门脉系统直接释放到垂体）含量也下降；而经过二仙汤的
15、治疗，同龄老年大鼠下丘脑GnRH mRNA含量、垂体GnRH含量较老年对照大鼠增加，表明二仙汤治疗更年期综合征取效的部分机制与该处方延缓下丘脑GnRH神经元的衰老，并增进其功能有关。,22,那么以上的作用是对细胞产生的直接作用，还是间接的？ 研究发现来源于不同部位的GnRH细胞系，对GnRH的表达数量有着很大的区别。比如GT1-7（来源于发生在前脑的肿瘤，接近GnRH细胞迁徙的终点）可以高表达GnRH，而Gn10（来源于GnRH细胞迁徙途中的肿瘤）GnRH表达甚微这些细胞系成为理想的研究工具。,23,上海第二医科大学进而采用细胞生物学的研究方法，发现与若干常用经典温肾中药复方相比，二仙汤能使G
16、nRH细胞系GT1-7的GnRH分泌峰提前，并维持时间最长。 这些研究采用了细胞生物学和分子生物学技术加深了我们对中药复方作用机制的认识。如果不借助分子生物学、细胞生物学的技术和方法，我们便难以高效、准确、深入地观察到中药复方作用的分子机制，也就无从开展更进一步的深入研究，并在此基础上发展和丰富中医药学。,24,医学和生命学科的研究探索是没有止境的。依据以上研究结果，我们自然会关心：GnRH基因是如何表达的？近十年来所采用的分子生物学技术研究表明，GnRH基因有3000bp左右的启动子，在这些启动子上一些区域在特定的细胞系中对于GnRH基因的高表达十分重要，被称之为增强子。GnRH细胞在胚胎初始由鼻小坑向下丘脑迁徙，并逐步分化成熟，标志之一是该启动子被一些不明的核蛋白所活跃，GnRH基因出现表达。GnRH基因启动子 GnRH基因序列增强子 增强子,25,鉴此，研究人员推测两个细胞系中调节GnRH基因启动子的核蛋白构成会有所不同，由于这些核蛋白的构成不同，导致两个细胞系GnRH表达的多寡。我们采用分子生物学足迹法（Footprint）技术发现，来源于GT1-7和Gn10两个细胞系的核蛋白在GnRH启动子，尤其是其增强子上结合的数量以及所结合的DNA序列确实有所异同，可以推测，这些不同的结合蛋白可能是调节GnRH表达数量多寡的重要蛋白，由此也提示两个细胞系中基因的表达有所差异。,
