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1、第四章 基因工程过程,下载后可浏览全文,下载后可浏览全文,下载后可浏览全文,下载后可浏览全文,下载后可浏览全文,下载后可浏览全文,下载后可浏览全文,下载后可浏览全文,转化的原理与技术,细菌转化的全过程包括五个步骤： (1)感受态的形成。典型的革兰氏阳性细菌由于细胞壁较厚，形成感受态时细胞表面发生明显的变化，出现各种蛋白质和酶类，负责转化因子的结合、切割及加工。感受态细胞能分泌一种小分子量的激活蛋白或感受因子，其功能是与细胞表面受体结合，诱导某些与感受态有关的特征性蛋白质(如细菌溶素)的合成，使细菌膜壁部分溶解，局部暴露出细胞膜上的DNA结合蛋白和核酸酶等； (2)转化因子的结合。受体菌细胞膜上
2、的DNA结合蛋白可与转化因子的双链DNA结构特异性结合，单链DNA或RNA、双链RNA以及DNARNA杂交双链都不能结合在膜上，,(3)转化因子的吸收。双链DNA分子与结合蛋白作用后，激活邻近的核酸酶，一条链被降解，而另一条链则被吸收到受体菌中，这个吸收过程为EDTA所抑制，可能是因为核酸酶活性需要二价阳离子的存在； (4)整合复合物前体的形成。进入受体细胞的单链DNA与另一种游离的蛋白因子结合，形成整合复合物前体结构，它能有效地保护单链DNA免受各种膜内核酸酶的降解，并将其引导至受体菌染色体DNA处； (5)转化因子单链DNA的整合。供体单链DNA片段通过同源重组，置换受体染色体DNA的同源
3、区域，形成异源杂合双链DNA结构。,革兰氏阴性细菌细胞表面的结构和组成均与革兰氏阳性细菌有所不同，供体DNA进入受体细胞的转化机制还不十分清楚。革兰氏阴性细菌在感受态的建立过程中伴随着几种膜蛋白的表达，它们负责识别和吸收外源DNA片段。研究表明，嗜血杆菌和奈氏杆菌均能识别自身的DNA，如嗜血杆菌所吸收的自身DNA片段中都有一段11bP的保守序列5AAGTGCGGTCA3。这表明革兰氏阴性细菌在转化过程中对供体DNA的吸收具有一定的序列特异性，受体细胞只吸收它自己或与其亲缘关系很近的DNA片段，外源DNA片段可以结合在感受态细胞的表面，但极少能吸收。与革兰氏阳性菌不同，嗜血杆菌和奈氏杆菌等革兰氏
4、阴性细菌的DNA是以完整的双链形式被吸收的，在整合作用发生之前，进入受体细胞内的双链DNA片段与相应的DNA结合蛋白结合，不为核酸酶所降解，DNA整合同样发生在单链水平上，另一条链以及被取代的受体菌单链DNA则被降解。,将处于对数生长期的细菌置入0的CaCl2低渗溶液中，使细胞膨胀，同时Ca2+使细胞膜磷脂层形成液晶结构，使得位于外膜与内膜间隙中的部分核酸酶离开所在区域，这就构成了大肠杆菌人工诱导的感受态。此时加入DNA，Ca 2+又与DNA结合形成抗脱氧核糖核酸酶(DNase)的羟基磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外表面上。经短暂的42热脉冲处理后，细菌细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，随之出
5、现许多间隙，致使通透性增加DNA分子便趁机进入细胞内。此外在上述转化过程中，Mg2+的存在对DNA的稳定性起很大的作用，MgCl2与CaCl2又对大肠杆菌某些菌株感受态细胞的建立具有独特的协同效应。 1983年，Hanahan除了用MgCl2与CaCl2 处理细胞外，还设计了一套用二甲基亚砜(DMSO)和二硫基苏糖醇(DTT)进一步诱导细胞产生高频感受态的程序，从而大大提高了大肠杆菌的转化效率。 目前，Ca2+诱导法已成功地用于大肠杆苗、葡萄球菌以及其他一些革兰氏阴性菌的转化。,以DNA为载体的重组DNA分子,由于其分子量较大，通常采取转染的方法将之导入受体细胞内。在转染之前必须对重组DNA分
6、子进行人工体外包装，使之成为具有感染活力的噬菌体颗粒。用于体外包装的蛋白质可以直接从大肠杆菌的溶原株中制备，现已商品化。这些包装蛋白通常分成分离放置且功能互补的两部分，一部分缺少K组分，另一部分缺少D组分。包装时，只有当这两部分的包装蛋白与重组DNA分子三者混合后，包装才能有效进行，任何一种蛋白包装溶液被重组分子污染后均不能包装成有感染活力的噬菌体颗粒.这种设计也是基于安全考虑.,整个包装操作过程与转化一样简单：将DNA与外源DNA片段的连接反应液与两种包装蛋白组分混合，在室温下放置lh，加入一滴氯仿，离心除去细菌碎片，即得重组噬菌体颗粒的悬浮液。将之稀释合适的倍数并与处于对数生长期的大肠杆菌
7、受体细胞混合涂布、过夜培养即可用于筛选与鉴定。,原核细菌的转化虽是一种较为普遍的遗传变异现象，但是目前仍只是在部分细菌的种属之间发现，如肺炎双球菌、芽泡杆菌、链球菌、假单抱杆菌以及放线菌等。而在肠杆菌科的一些细菌间很难进行转化，其主要原因是一方面转化因子难以被吸收，另一方面受体细胞内往往存在着降解线状转化因子的核酸酶系统。另外，细菌自然转化是自身进化的一种方式，通常伴随着DNA的整合，因此在DNA重组的转化实验中，很少采取自然转化的方法，而是通过物理方法将重组DNA分子导入受体细胞中，同时也对受体细胞进行遗传处理，使之丧失对外源DNA分子的降解作用，确保较高的转化效率。,在DNA体外重组实验中
8、，外源DNA片段与载体DNA的连接反应物一般不经分离直接用于转化，由于重组率和转化率不可能达到100的理想极限，因此必须使用各种筛选与鉴定手段区分: 转化子(接纳载体或重组分子的转化细胞)与非转化子(未接纳载体或重组分子的非转化细胞)、重组子(含有重组DNA分子的转化子)与非重组子(仅含有空载载体分子的转化子)，以及期望重组子(含有目的基因的重组子)与非期望重组子(不含目的基因的重组子)。,载体遗传标记检测,载体遗传标记法的原理是利用载体DNA分子上所携带的选择性遗传标记基因筛选转化子或重组子。由于标记基因所对应的遗传表型与受体细胞是互补的，因此在培养基中施加合适的选择压力，即可保证转化子显现
9、(长出菌落或噬菌斑)，而非转化子隐去(不生长)，这种方法称为正选择。经过一轮正选择，往往可使转化扩增物的筛选范围缩小成千上万倍。如果载体分子含有第二个标记基因，则可利用这个标记基因进行第二轮的正选择或负选择(视标记基因的性质而定)，从众多转化子中筛选出重组子。,下载后可浏览全文,下载后可浏览全文,(ABC标记法。将生物素(Biotin)共价交联在dUTP的碱基上通过反转录标记或缺口前移标记将这种单体掺入到探针中，杂交反应结束后、洗去非特异性结合的探针，然后用生物素结合蛋白(Avidin)处理薄膜，使得Avidin与探针上的生物素分子形成复合物,这就是所谓的ABC标记法。 生物素结合蛋白分子上可
10、以接有自然光或高强度荧光发射物质，也可连上特殊的酶分子(如碱性磷酸单酯酶或辣根酶等)，由其催化相应底物的显色反应。新一代的标记物则用dUTP地高辛化合物以及相应的抗体蛋白，但检测方法与生物素系统相同。这种标记方法的灵敏度丝毫不亚于同位素，却不会对人体造成放射性.,下载后可浏览全文,下载后可浏览全文,R-环检测法 R-环是指RNA通过取代与其序列一致的DNA链而与双链DNA杂交，被取代的DNA单链与RNA-DNA杂交双链所形成的环状结构。在临近双链DNA变性温度下和高浓度(70)的甲酰胺溶液中，即所谓的形成R-环的条件下，双链的DNA-RNA分子要比双链的DNA-DNA分子更为稳定。因此，将RN
11、A及DNA的混合物置于这种退火条件下，RNA便会同它的双链DNA分子中的互补序列退火形成稳定的DNA-RNA杂交分子，而被取代的另一条链处于单链状态。这种由单链DNA分支和双链DNA-RNA分支形成的“泡状”体，即所谓的R-环结构。R-环结构一旦形成就十分稳定，而且可以在电子显微镜下观察到。,应用R环检测法可以鉴定出双链DNA中存在的与特定RNA分子同源的区域。根据这样的原理，在有利于R环形成的条件下，使得检测的纯化的质粒DNA，在含有mRNA分子的缓冲液中局部地变性。如果质粒DNA分子上存在着与mRNA探针互补的序列，那么这种mRNA就将取代DNA分子中的相应的互补链，形成R-环结构。然后放
12、置在电子显微镜下观察，这样便可以检测出重组体质粒的DNA分子。,表达载体产物之免疫化学检测法,下载后可浏览全文,免疫化学检测法可分为放射性抗体测定法(radio active antibody test)和免疫沉淀测定法(immuno precipitation test)。这些方法最突出的优点是，它们能够检测不为寄主提供任何可选择的表型特征的克隆基因。不过，这些方法需要使用特异性的抗体。 1放射性抗体检测法 2免疫沉淀检测法 3表达载体产物之免疫化学检测法,免疫沉淀检测法,免疫沉淀检测法同样也可以鉴定产生蛋白质的菌落。其做法是：在生长菌落的琼脂培养基中加入专门抗这种蛋白质分子的特异性抗体，如
13、果被检测菌落的细菌能够分泌出特定的蛋白质，那么在它的周围，就会出现一条由一种叫做沉淀素(preciptin)的抗原抗体沉淀物所形成的白色的圆圈。,常用的重组体分子的物理检测法有凝胶电泳检测法和R环检测法。 琼脂糖凝胶电泳Agarose Gel Electrophoresis,Sample Well 25 ng 1 kb ladder 0.8% Agarose,1,2,4,6,8,10,12,kb,Agarose Gel ElectrophoresisSybergold Detection Limit: 0.2-0.5 ng DNAEtBr Detection Limit: 5-10 ng DN
14、A,(Not in handout),Log (MW) is linearly related to mobility,4,100 bp,Low % has no Resolving power at low MW,1 kb,10 kb,High % has no resolving power at high MW,Separation Range Vs. % Agarose,5,Low Geling Agarose 4-6 0.02-0.4,聚丙烯酰胺凝胶电泳 PolyAcrylamide Gels,8,PFGE（ pulsed-field gel electrophoresis ）脉冲电
15、场凝胶电泳,在脉冲电场中，DNA分子的迁移方向是随着所用的电场方向的周期性变化而不断改变的。在标准的PFGE中，头一个脉冲的电场方向与核酸移动方向成45。夹角，而下一个脉冲的电场方向与核酸移动方向在另一侧亦成45。夹角。由于加压在琼脂糖凝胶上的电场方向、电流大小、及作用时间都在交替的变换着，这就使得DNA分子能够随时地调整其游动方向，以适应凝胶孔隙的无规则变化。与分子量较小的DNA分子相比，分子量较大的DNA分子需要更多的次数来更换其构型和方位，以使其可以按新的方向游动。因此，在琼脂糖介质中的迁移速率也就显得更慢一些，从而达到了分离超大分子量DNA分子的目的。已报道，应用脉冲电场凝胶电泳技术，可成功地分离到分子量高达107bp的DNA大分子。,a,c,b,脉冲电场凝胶电泳,箭头a和b表示每次脉冲所用的电场方向，箭头c表示DNA分子 的最终游动方向。头一次脉冲电场方向a和DNA最终游动方向 C，在左侧形成45。夹角；下一次脉冲电场方向b和DNA最终 游动方向c，在右侧形成45。夹角。,PFGE（脉冲电场凝胶电泳） can resolve large DNAfragments,10,PFGE基本步骤： 将研究材料的细胞埋藏在低熔点琼脂糖中。 然后加入有关酶及反应试剂，从细胞蛋白质和RNA混合物中游离出DNA。 用限制性内切酶进行切割。 电泳,PFGE电泳技术的发展,
