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1、欢迎参加岛津液相维修培训班,采用 “HPLC” 级溶剂 避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂 对试样有适宜的溶解度 溶剂粘度要小 与检测器相匹配,流动相的选择,其他问题,其他问题,水的等级 纯化水 蒸馏水 去离子水,波长 (nm),纯化水,去离子水,因为不纯物的存在，去离子的吸光率较高,纯化水中去除了无机和有机的污染物,吸光率,其他问题,水 / MeOH梯度ODS 柱,鬼峰,Gradient Curve,1 ml/min, 0-100% MeOH over 10 mins and hold for 15 mins.,鬼峰的出现,其他问题,溶剂的等级 HPLC级 优级纯 分析纯,都经过蒸馏
2、和0.45u的过滤(除纤维毛,未溶解的机械颗粒,优级纯的纯度比分析纯大,但里面含有防腐剂和抗氧化剂,HPLC级经过0.2u的过滤,且除去有紫外吸收的杂质,微量分析、梯度洗脱,其他问题,甲醇 乙睛 正己烷,分析纯级和 HPLC 级溶剂的吸光度比较图,其他问题,溶剂的过滤滤膜类型：聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐。醋酸纤维滤膜：不适用于有机溶剂，特别适用于水基溶剂。尼龙66滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可以用于强酸，不适用于二甲基甲酰胺。再生纤维素滤膜：蛋白吸收低，同样适用于水溶性样品和有机溶剂,脱气：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡 气泡对测定的影响：1）泵中气泡使液流波动，改
3、变保留时间和峰面积2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形3）检测器中的气泡产生基线波动,其他问题,脱气的目的,1. 防止由气泡的产生引起的故障2. 防止由溶解（在液体中的）气体量 的变动引起的检测不稳定程度1）示差折射率检测器*使折射率变化2）UV检测器（200nm以下）*溶解氧气有吸收3）荧光检测器*溶解氧气有消光作用,其他问题,其他问题,脱气的方法,1. 超身波脱气法 2. He清除法 3. 使用氟树脂膜的减压脱气法,其他问题,He清除法,调压阀,排气阀,往送液泵,流动相,过滤器,其他问题,氟树脂膜,真空室,往送液泵,真空泵,控制器,流动相,使用氟树脂膜的减压脱气法,梯度洗脱法,梯度洗脱装置：
4、高压梯度：用两台高压输液泵将两种溶剂输入 低压梯度：在常压下将两种溶剂（或多元溶剂）混合，然后用高压输液泵将流动相输入到色谱柱中。 梯度洗脱：优点： 可提高分离度、缩短分离时间、降低最小检测量和提高分离精度,梯度洗脱法的注意点,溶剂的纯度要高，否则梯度洗脱的重现性差 梯度混合的溶剂互溶性要好 梯度洗脱应使用对流动相组成变化不敏感的选择性检测器（如紫外吸收检测器或荧光检测器），而不能使用对流动相组成变化敏感的通用型检测器（如示差折光检测器） 查看空白实验的数据。 遵守分析周期。（最初的分析数据不采用）,样 品 处 理,1. 使用流动相溶解样品- 减少溶剂峰，尤其是组分峰靠近溶剂峰时由为重要- 保
5、证样品在流动相中的溶解度，避免样品在系统中尤其在柱中产生沉淀,其他问题,缓冲液,选择缓冲液的步骤1 .确定最佳分离状态时的流动相pH2 .选择具有与流动相的pH相近的pKa 的缓冲液（即使浓度稀也具有较强能力的缓冲液）3 .确认检测波长下缓冲液是否有大的吸收（在波长210nm附近进行检测时，不能用醋酸和 柠檬酸的缓冲液）,一些代表性弱酸的pKa,pK1 pK2 pK3醋酸 4.87柠檬酸 3.13 4.76 6.40磷酸 2.16 7.2 1 12.32,其他问题,缓冲液的使用,使用前必须过滤使用后一定要进行清洗 ，以免造成腐蚀、磨损、阻塞:用纯水冲洗30-60min（1ml/min），再用甲
6、醇冲洗30min 易受到细菌和霉菌的影响,不能直接用有机溶剂冲洗,液相色谱容易出问题的部件,维护流程图,吸滤头,单向阀,柱塞密封圈,线路过滤器,手动进样器,检测器,管线选择,材料不锈钢TeflonPEEK (聚醚酮) 尺寸0.1 mmI.D. x 1.6 mmO.D. 0.3 mmI.D. x 1.6 mmO.D.0.5 mmI.D. x 1.6 mmO.D.0.8 mmI.D. x 1.6 mmO.D.,管线材料,不锈钢 (可用于所有连接) 能承受几千 kg/cm2 压力 酸性或高浓度盐环境中易腐蚀 (尤其在pH小于2时) PEEK (可用于所有连接) 能承受高达 250 kg/cm2压力
7、可在整个PH范围(pH 1-14)内使用 不适用于高溶解性溶剂如氯仿等 Teflon (用于柱后阻尼管、反应管和排液管) 化学惰性大 能承受 5 kgf/cm2 压力,材料：不锈钢烧结，孔径10um 故障：堵塞 表现：管路中不断有气泡生成 措施：用520的稀硝酸，超声波清洗，再用蒸馏水清洗 注意点：吸滤头拆下时不必将塑料管剪断,吸滤头,液相色谱容易出问题的部件,LC-10ATvp泵：串联 式往复泵,LC-10ADvp泵：并联式 往复泵,液相色谱容易出问题的部件,液相色谱容易出问题的部件,单向阀结构,流动相,单向阀原理,液相色谱容易出问题的部件,故障1：宝石球粘附于垫片 表现：泵无法吸液或排液，
8、流路不通 措施：1）用针筒抽出口单向阀以产生负压，使宝石球与垫片分开2）拆下单向阀，放入异丙醇或水中，用超声波清洗,单向阀,液相色谱容易出问题的部件,故障2：宝石球或塑料垫片受污导致密封不好 表现：系统压力波动大 措施：拆下单向阀，放入异丙醇或水中，用超声波清洗,单向阀,故障：密封圈磨损而导致密封不良 现象：系统压力波动大或漏夜措施：更换密封圈 注意点：更换密封圈拆卸泵头前，柱塞杆复位 （PSET）,柱塞密封圈,液相色谱容易出问题的部件,故障：堵塞 现象：系统压力波动大或压力偏高 措施：5稀硝酸，超声波清 洗 判断依据：关闭排液阀，断开出口管路，设定流速1mL/min，如压力3kgf/cm2，
9、则可能堵塞。,线路过滤器,排液阀,压力传感器,线路过滤器,流动相,液相色谱容易出问题的部件,液相色谱容易出问题的部件,进样器,自动进样器 手动进样器原理：（六通阀）注入方式：1）全量注入2）部分注入,液相色谱容易出问题的部件,进样量和检测器响应的关系示意图,进样体积,检测器响应值,定量环体积的一半,3倍定量环体积,全量注入,部分注入,手动进样器的原理图,装填状态,进样状态,交叉污染的原因,便捷的方法（不需清洗）1.进样状态下插入微量注射器2.切到装填状态3.注入样品4.切回到进样状态,手动进样法,操作注意点： 1）插针应插到底 2）进样应使用液相色谱专用平头进样针 3）清洗应使用专用针口清洗器
10、,手动进样器,定子,转子,塑料箍,弹簧,不锈钢套,液相色谱容易出问题的部件,手动进样阀故障：转子密封损坏现象：漏液原因：a 拧的太紧b 样品太脏c 针头损坏或不使用液相专用针解决措施：更换转子密封，并在使用,液相色谱容易出问题的部件,液相色谱容易出问题的部件,手动进样阀故障：载样困难原因：a 定量环堵塞b 进样器污染解决措施：清洗或更换定量环、进样器,液相色谱容易出问题的部件,分析结果重现性好 提高柱效 降低柱压 保证检测稳定性,柱子故障：系统高压、峰型变差（拖尾峰、前沿峰、分叉峰），保留时间的改变解决措施：清洗正相柱，正庚烷、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醇反相柱，甲醇、乙腈、氯仿、异丙醇、0.0
11、5M稀硫酸,液相色谱容易出问题的部件,液相色谱容易出问题的部件,峰产生有肩或分叉的原因,1. 柱子劣化（进口处产生不均匀的空隙） 2. 样品劣化（生成氧化物、分解物等）,判断标准所有的峰都产生有肩峰或分叉时则为柱子劣化,延长柱寿命方法：倒冲柱换过滤片修补柱头,液相色谱容易出问题的部件,液相色谱容易出问题的部件,柱的补修,填料的取出,液相色谱容易出问题的部件,恢复例,液相色谱容易出问题的部件,硅胶基底,聚合物基底,pH 范围,2 - 7.5,宽范围,有机溶剂,所有,有限制,压力, 250 kgf/cm2,低压,温度,宽范围,60C,色谱柱的类型及适用范围,液相色谱容易出问题的部件,分 析 柱 的
12、 维 护,在使用新柱之前，最好用强溶剂在低流量下 (0.2-0.3 ml/min)冲洗 30 mins，长时间未用的分析柱也要同样 处理 定期使用强溶剂冲洗柱子 3、使用缓冲盐时，要先用水冲洗，再用有机溶剂冲洗 4、净化样品 5、分离条件 6、不使用时，要盖上盖子，避免固定相干枯 7、使用预柱 8、避免流动相组成及极性的剧烈变化 9、避免压力脉冲的剧烈变化,液相色谱容易出问题的部件,柱压低于150kgf/cm2 柱温在40左右，最高使用温度为50 缓冲液PH使用范围为27 流动相有机溶剂比例过低, 柱效下降快,硅胶在PH为34时稳定性最好 碱浓度越低，流动相含水量越低，硅胶越稳定。,ODS柱的
13、使用注意点：,液相色谱容易出问题的部件,紫外检测器,参比池,样品池,光线,光电倍增管,液相色谱容易出问题的部件,更换氘灯（紫外检测器）,判断氘灯能量：设定220nm波长，检查参比池能量，如 能量低于800，需更换氘灯。操作注意点：不要用手直接接触氘灯表面,液相色谱容易出问题的部件,液相色谱容易出问题的部件,故障：样品池受污 表现：样品池和参比池能量相差较大 检查方法：设定250nm波长，通甲醇或水，查看SMPL EN和 REF EN，如两者相差较大，则样品池受污。 措施：用针筒注入异丙醇，清洗样品池；如污染严重， 拆开样品池，将透镜等放入异丙醇中超声波清洗。,紫外检测器,示差折光检测器,原理：
14、连续测定流通池中溶液折射率来测定试样中各组分浓度。 优点：通用型检测器， 缺点： 1）对温度变化敏感 2）对溶剂组成变化敏感，不能用于梯度检测 3）属于中等灵敏度的检测器,液相色谱常见问题及其对策,液相色谱常见问题类型A. 压力异常（偏高、波动）B. 漏液 C. 保留时间漂移D. 基线问题（漂移、噪声） E. 峰形异常,现象：无压力，流动相不流动 可能原因1、保险丝断或电源问题2、柱塞杆折断3、泵头内有空气或流动相不足4、单向阀损坏5、漏液6、压力传感器损坏(流动相流动正常，但无压力),压力异常,现象：压力持续偏高或不断上升1、流速设定过高2、保护柱或柱子筛板堵塞3、流动相使用不当或有缓冲盐析
15、出4、色谱柱选择不当5、进样阀损坏6、线路过滤器堵塞,压力异常,压力异常,现象：压力持续偏低1、流速设定过低2、色谱柱选择不当3、柱温过高4、系统漏液,现象：压力持续偏低1、流速设定过低2、色谱柱选择不当3、柱温过高4、系统漏液,压力异常,压力异常,现象：压力波动 可能原因1、泵头中有气泡2、单向阀损坏3、柱塞密封圈损坏4、脱气不充分5、系统漏液6、使用了梯度洗脱,漏液,接头处漏液1、接头处松动2、接头磨损3、接头被污染4、部件不匹配,漏液,泵漏液1、单向阀松动2、泵密封损坏3、放空阀损坏4、接头松动（不要拧的太紧）,漏液,泵漏液1、单向阀松动2、泵密封损坏3、放空阀损坏4、接头松动（不要拧的太紧）,进样阀漏液可能原因1、转子密封损坏2、定量环堵塞3、进样口密封松动4、进样针尺寸不合适5、废液管产生虹吸6、废液管堵塞,漏液,检测器漏液可能原因1、流通池垫片损坏2、流通池透镜破碎 3、手紧接头处漏液4、进样针尺寸不合适5、废液管堵塞6、流通池堵塞,
