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1、番茄不成熟基因 nor 的 AFLP 分子标记研究进展番茄果实成熟后很快变软不耐贮藏和运输销售旺季大量番茄腐烂变质，造成很大的损失。据报道每年番茄采后损耗量占总产量的 1520。采收绿熟果实虽可以提高耐贮运性，但果实风味较差，着色不匀，品质下降。所以长期以来人们一直盼望能培育出一种既能延长贮藏时间又可保持其优良品质的番茄新品种。利用番茄成熟突变体中的不成熟基因培育耐贮品种是提高番茄果实货架寿命延长番茄贮藏期的一种途径。1 番茄不成熟基因的研究进展11 番茄不成熟基因的发现不成熟基因 nor(non-ripening)为单个隐性基因位于第 10 条染色体上，由加拿大安大略园艺研究所的 Kerr
2、在 ItaJian Winter 品种中获得与位于第10S 一 19 的果实均匀着色突变体 u(uniforn ripening)紧密连锁(大约 35 个遗传单位)。12 含不成熟基因番茄的特点近年来，番茄育种专家先后发现了多种番茄成熟突变体如永不成熟基因Nr(never ripe)、成熟抑制基因 rin(ripen inginhibitor)、不成熟基因nor(non-ripening)及晚成熟基因 ac(alcobaca)等，它们的共同特性是果实成熟过程非常缓慢产生很少的番茄红素果实硬度大不产生或产生微量果实软化酶多聚半乳糖醛酸酶(PG)，成熟过程无呼吸跃变。果实在常温下可贮藏 2-3 个
3、月不腐烂。但对番茄的品质特性有副作用。121 nor 突变体及其杂合体的呼吸特点 据报道番茄成熟突变体rin、nor 果实均属于无呼吸跃变型主要表现在从绿熟期采收到贮藏 1 个多月番茄乙烯含量和呼吸强度均很低，属于细胞质遗传例。番茄正常成熟果实在采后 34 d 迅速达到呼吸高峰，而 nor 突变体果实无呼吸高峰。杂合体(nor+/nor)果实呼吸行为与正常果实不同从呼吸高峰前期呼吸率最低点到呼吸高峰时间延长。呼吸高峰前期最小值和高峰呼吸率分别只有正常成熟果实的65和 45(图 1)。122 果实果胶溶解酶、多聚半乳糖醛酸酶的活性变化 番茄果实硬度是果实品质构成要素之一与采后贮运特性有密切关系因
4、此保持番茄硬度是提高番茄货架寿命的有效途径。魏宝东等认为果肉硬度与不溶性果胶呈极显著正相关与可溶性果胶呈极显著负相关。不溶性果胶含量越高果实越硬则货架寿命越长，因此不溶性果胶含量是影响果实硬度进而影响货架寿命的最直接内因。使果胶降解而影响果实硬度的酶主要有果胶甲酯酶(PE)和PG。PE 可将酯化的果胶变成果胶酸PG 能催化富含多聚半乳糖醛酸酶的果胶质水解使解离的水溶性细胞壁组成遭受不同程度的降解，导致果实软化硬度下降。正常果实在成熟期间迅速变软软化与着色速度相一致，采收后 l 周内硬度下降最快。杂合体(nor+nor)果实软化比正常果实晚 45 周着色比正常果实晚 2-3 周。nornor 及
5、 nor+nor 果实内的果胶溶解酶、多聚半乳糖醛酸酶的活性被全部和部分抑制果实中果胶的溶解受到影响从而改变了果实的正常软化过程。研究报道突变体(nornor)果实中没有多聚半乳糖醛酸酶(PG)而杂合体果实转色后 PG 积累缓慢(表 1)。同时经过对多种成熟突变体特性的分析、鉴定发现 nor 突变体基因材料在室温下可贮藏 2 个多月。果实在转色期采收贮藏最终果实颜色呈橙黄色，且品质与正常番茄相近正常果实着色后 4 d PG活性提高。而在 nor+nor 果实中则未出现 PG。转色后第 10 天正常果实已进入成熟阶段，nor+nor 果实仍很硬，表现出少量 PG，仅为同时期正常果实的 16。12
6、3 含不成熟基因番茄的细胞超微结构特点据刘愚等 114-15报道果皮细胞中作为核质之间物质和信息交换重要通道核孔其数量和大小在番茄成熟过程中发生显著变化同时与乙烯的生成有着密切的联系。正常果实近表皮薄壁细胞大而扁长：而 nornor 果实近表皮薄壁细胞形状小且圆细胞排列形状也较为紧密；nor+nor 果实的薄壁细胞大小、扁圆程度居中。这一结构特点说明 nornor 及 nor+nor 果实的耐贮、抗压能力强于正常果实。124 含不成熟基因番茄的耐贮性特点 果实耐贮性是番茄果实主要性状之一目前主要通过 2 种途径延长番茄的贮存期：一是通过提高 PG 的活性来抑制细胞壁果胶的降解，使果实抗软化：另
7、一种是通过抑制乙烯的合成提高果实耐受“成熟过度”的能力。经过对多种成熟突变体特性的分析、鉴定发现 nor 突变体基因材料在室温下可贮藏 2 个多月果实在转色期采收贮藏。最终果实颜色呈橙黄色且品质与正常番茄相近。陆春贵等目的研究为不成熟基因对番茄果实货架寿命的影响提供了有力的证据：在突变体材料 alc，rin，nor 中，rm 番茄果实贮藏指数最高其次是nor 和 alc。正常成熟的品种，一般仅能贮藏 1 周左右，而 rin，nor 和 alc 可贮藏 2-3 个月。含耐贮基因的品种与正常成熟品种杂交后其贮藏性显著下降但比正常成熟品种的贮藏期长 10-15 d。2 不成熟基因在番茄育种中的应用通
8、过转基因技术获得的耐贮番茄是最早实现商品化生产的转基因蔬菜作物。1994 年 4 月美国加利福尼亚基因公司培育的 Flavr Savr 耐贮番茄已通过美国食品和药物管理局的使用安全性检验并开始在美国加利福尼亚和伊利诺斯州的超级市场上出售这是首例通过基因工程获得的食品。叶志彪等将氨基环丙烷羧酸 fACC)合成酶 EFE 反义基因转入番茄获得的耐贮番茄华番 1 号在1330下可贮藏 45 d于 1996 年被批准为我国第 1 个商品化生产的农业基因工程产品。经过对多种成熟突变体特性的分析、鉴定发现 nor 突变体基因材料 Long Keeper 果实在转色期采收，室温下可贮藏 2 个多月最终果实呈
9、橙黄色，且品质与正常番茄相近_2ll。耐贮番茄长龄就是含有隐性纯合耐贮基因(nor/nor)的一代杂种，其母本双黄 5 号是矮黄品种与含纯合 nor 基因的材料杂交经后代分离选择而成。它既含有 Tm-2nv 抗病基因又含有耐贮 nor 基因：其父本139F2-9-2-1-I 由园艺性状优良、不耐贮材料 84-142 与含有 nor 基因的材料LongKeeper 杂交经 7 代系统选择而成。3 AFLP 分子标记31 AFLP 分子标记技术AFLP 分析是 PCR 与酶切相结合的一种技术是由荷兰科学家 Zabeau 等在1993 年发明的荷兰 Keygene 公司拥有该项技术的专利其基本原理是
10、通过选择性扩增基因组 DNA 的酶切片段而产生多态性选择性扩增是通过引物的末端加上选择性核苷酸而实现的 AFLP 结合了 RFLP 和 RAPD 各自的优点方便快速。只需要极少量 DNA 材料不需要 Southern 杂交不需要预先知道 DNA 的顺序信息实验结果又稳定可靠可以快速获得大量的信息AFLP 产物呈典型的孟德尔方式遗传等特点被称为最有力的分子标记或下一代分子标记因而可以应用于一般分子标记的所有应用范围，如种质资源分类、系统发育、品种鉴别、遗传图谱构建及目的基因定位等各项研究。目前许多学者正致力于应用 AFLP 技术进行抗性基因标记及定位Zhang 等利用野生种多毛番茄与栽培种杂交鉴
11、定了控制早疫病抗性的 7 个 OTL 位于番茄的 7 个染色体上而且除染色体 3 上的一个 OTL 位点外其他的均来自于抗性野生种检测到的 OTLs 可以用于番茄分子辅助选择育种。英国 Thomas 等利用番茄与野生种 Lvcopersicon pennellii 种间杂交 F1 代群体发现 42 000 条AFLP 带纹与番茄抗叶霉菌基因 Cf-9 紧密连锁其中 3 个标记与 Cf-9 基因表现共分离。Wong 等利用 AFLP 技术研究了香蕉的遗传多样性筛选到马来半岛的尖叶蕉(Macuminata)是野生蕉的 1 个核心种质资源是 1 个能代表 3 个亚种基因组的野生种。32 AFLP 分
12、子标记在番茄育种中的应用321 标记辅助选择 AFLP 分子标记作为 DNA 分子标记的一种在植物育种中的应用首先是要分析不同品种间的多态性或者构建遗传图谱对与经济性状紧密相连的基因或 OTLs 进行标记然后利用其判断目标基因存在与否以便追踪这些基因并且在育种中谨慎地做出选择实现分子标记辅助选择(molecular marker-assisted selection，MAS)。它是现代分子生物学与传统遗传育种的结合点借助分子标记可以对育种材料从 DNA 水平上进行选择加快选择进度增强选择的准确性从而显著提高育种效率。寿森炎等以番茄高抗青枯病品种 rr51A 与高感青枯病品种 T9230 为材料
13、用 64 个 EcoR IMse I 引物组合对 2 个亲本及其 F2 代抗病和感病基因池进行了 AFLP 标记分析扩增出的约 4 200 条带中有 2 条为稳定差异。经过 n 代分离群体对 2 个特异条带与目的基因的遗传连锁性进行分析结果表明特异条带 AAGCAT 与抗青枯病基因 RRS-342(暂定名)紧密连锁二者之间的遗传距离为 67 cM。将 AAGCAT 片段回收、克隆及测序，将其成功地转化为 SCAR 标记可以进一步应用于标记辅助育种。322 番茄遗传图谱的构建 番茄遗传图谱的构建在番茄基因组研究中起了非常重要的作用它可以为基因定位、基因克隆、基因组结构和功能的研究，和番茄的分子标
14、记辅助育种打下良好的基础。AFLP 能够揭示大量的多态性位点可以弥补传统的 RFLP 标记多态性低的缺点因而 AFLP 可以构建高密度的遗传图使基因组能完全被分子标记覆盖无很大的标记空隙，可以检测数量性状基因(OTL)。目前，已在许多植物上开始了 AFLP 建图工作有的利用AFLP 标记填充原有遗传图的间隙(Cap)，使得遗传图的精度大大提高。Donini等在马铃薯 RFLP 的分子遗传连锁图谱基础上用 AFLP 分析获得了 3 200 个AFLP 片段找到了 29 个 AFLP 标记与马铃薯第 5 染色体上 R1 基因紧密连锁。Tanksley 等于 1992 年以栽培番茄 Lvcooers
15、icon escu lentumcv VF36-Tm2a 与潘那利番茄 Lvcoosersicon penneHii LA716 的 F2 代群体构建了高密度遗传图谱这张图谱的遗传标记以 RFLP 为主并包括同工酶和形态学等遗传标记共有遗传标记 l 030 个总长度为 1 276 cM平均每 12 cM 就有 1 个标记并与经典图、细胞图作了对比，使番茄的遗传图谱达到一个新的水平。323 基因定位 蔬菜作物的许多重要的农艺性状一部分表现为质量性状遗传的特点如某些抗性和育性等：另一部分表现为数量性状遗传特点大多数经济性状是数量性状如产量、品质、抗逆性、成熟期和某些抗病性等。质量性状是分离群体中表现为不连续变异而显示质的差异的性状近等基因系分析法(NILS)和分离群体分组分析法(BSA)是寻找与目标基因紧密连锁的分子标记的有效方法。这 2 种方法主要运用于质量性状基因定位的研究。数量性状是一类受多基因控制的复杂性状。多基因在染色体上的位置称为数量性状基因座(OTL)研究数量性状的遗传进行基因定位和效应估计对蔬菜作物数量性状的遗传改良至关重要。Thomas 等用 BSA 方法在普通番茄(Lvcopersicon esculentum)(cf-9)xLpennel 一 lii 的 F，世代中筛选了近 42000 个 AFLP 座位获得 3 个与 cf-9 共分离的 A
