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1、第六章 常用分子生物学技术,1.掌握：常用分子生物学技术的基本概念与基本原理。 2.熟悉：常用分子生物学的基本方法。 3.了解：常用分子生物学技术研究进展以及在药学中的应用。,第一节 分子杂交技术,一、核酸分子杂交的基本原理 二、核酸探针及标记 三、核酸分子杂交的应用Southern 印迹 Northern 印迹 Western 印迹 原位杂交生物芯片,原理,分子杂交技术是利用单链核酸碱基互补配对，抗原与抗体、受体与配体、蛋白与其它分子的相互作用进行目的核酸、蛋白检测的技术。,DNA变性在某些因素的作用下，双链间氢键断裂，双螺旋结构解开，形成无规则线团状分子的过程。,本质是双链间的氢键的断裂,
2、变性的DNA在适当的条件下，两条彼此分开的DNA单链重新缔合成为双螺旋结构的过程。,变性,复性,复性：变性的逆过程。,复性,在DNA变性后的复性过程中，如果将不同种类的DNA单链分子或RNA分子放在同一溶液中，只要两种单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，在适宜的条件（温度及离子强度）下，就可以在不同的分子间形成杂化双链(heteroduplex)。 这种杂化双链可以在不同的DNA与DNA之间形成，也可以在DNA和RNA分子间或者RNA与RNA分子间形成。这种现象称为核酸分子杂交。,核酸分子杂交(hybridization),DNA-DNA 杂交双链分子,不同来源的DNA分子,定义：核酸探
3、针是指能与特定核酸序列发生特异性互补的已知核酸片段。一般而言，核酸探针带有特殊的标记物。,二、核酸探针及标记,动画,制备特异性探针所需要的基本条件,1.被检基因结构清楚；2.有明确的基因产物;具备以上条件之一就可以制备特异性基因探针。,探针所携带的标记物应具备的条件：,标记后的探针的分子结构要尽可能与原来的分子结构相同，绝不影响其碱基配对特异性，不影响探针分子的主要理化特性，尤其是杂交特性。 标记探针的检测方法简便、省时、准确可靠、重复性好、灵敏度高。 稳定性好、环境污染少、价廉。,常用的探针标记物：,放射性同位素：3H、32P、35S、125I等。 非放射性同位素：地高辛素、辣根过氧化酶、碱
4、性磷酸酶等。,三、分子杂交的应用,Southern 印迹法 Northern 印迹 Western 印迹法 原位杂交 生物芯片,一、Southern 印迹杂交,1975年，英国Southern创建 DNA/DNA杂交，即将DNA电泳、转印到固相支持物上，用探针进行检测的方法。,Southern 杂交(Southern bloting)的主要步骤,待测DNA样品的制备、酶切 待测DNA 样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳 凝胶中DNA的变性：碱变性 Southern转膜： 硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜 毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法 探针的制备Southern杂交 杂交结果的检测,South
5、ern Blot,D:/%E5%BC%A0%E4%BC%9A%E5%8B%87/%E5%BC%A0%E4%BC%9A%E5%8B%87%E4%B8%8A%E8%AF%BE%E5%86%85%E5%AE%B9/%E8%8D%AF%E5%AD%A6%E5%88%86%E5%AD%90%E8%AF%BE%E4%BB%B6/%E5%88%86%E5%AD%90%E7%94%9F%E7%89%A9%E5%B8%B8%E7%94%A8%E6%8A%80%E6%9C%AF/SouthernHybridization.mov,二、Northern 印迹杂交(Northern bloting),检测RNA（主要
6、是mRNA）的方法 与Southern杂交的不同 靶核酸：RNA RNA电泳 转膜：不需变性,原位杂交(in situ hybridization),将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交。 特点 能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究 不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序列灵敏度高,核酸原位杂交的基本步骤,细胞或组织的固定：载玻片 组织细胞杂交前的预处理 用去垢剂或蛋白酶除去核酸表面蛋白质 探针的选择和标记 杂交 杂交结果检测,利用FISH技术诊断Down综合征,图示：利用21号染色体特异性探针对一位高龄妊娠妇女进行产前诊断，未培养的羊水细胞进行荧光原位杂交, 显
7、示所检测的细胞均 有3个杂交信号,经选择性人工流产后确诊为Down综合征患儿。,Molecular Biology,生命科学技术系细胞生物及遗传学教研室,Molecular Biology,生命科学技术系细胞生物及遗传学教研室,三、 Western blotting,免疫印迹(Immunoblotting)或蛋白质印迹(Western blotting)是检测目标蛋白质的一项十分有效的方法。,Molecular Biology,生命科学技术系细胞生物及遗传学教研室,Molecular Biology,生命科学技术系细胞生物及遗传学教研室,蛋白质样品,电泳,非标记抗体（一抗）发生免疫反应,荧光素
8、酶或放射性同位素标记的第二抗体起反应,通过显色或放射自显影法检测凝胶中的蛋白质成分,转膜（硝酸纤维素薄膜）,方法：,Molecular Biology,生命科学技术系细胞生物及遗传学教研室,Western Blotting,Molecular Biology,生命科学技术系细胞生物及遗传学教研室,2018/9/14,24,2. 蛋白质印迹法 用于二级抗体的检测有以下三种： 放射性标记的抗体 与酶偶联的抗体 与生物素相偶联的抗体,25,PTB,Beta-actin,- P+ P+ P+ P+,A protein gel stained by Coomassie Blue,Western anal
9、ysis using two specific antibodies,三种印迹技术的比较,五、DNA芯片技术的概念,基因芯片(Gene chip)技术是指通过微阵列(Microarray)技术将高密度DNA片段阵列通过高速机器人或原位合成方式以一定的顺序或排列方式使其附着在如玻璃片等固相表面，以荧光标记的DNA探针，借助碱基互补杂交原理，进行大量的基因表达及监测等方面研究的最新革命性技术。,基因芯片,A. 用于微阵列芯片制作的点样仪。；B. 封装在卡盒中的微阵列芯片; C. 用于微阵列芯片荧光标记检测的激光共聚焦扫描器；D. 微阵列芯片的局部放大；E. 微阵列芯片上固定DNA探针的示意图。图中
10、蓝色的DNA链是预先固定在芯片表面的捕获探针，红色的DNA链是与捕获探针互补的靶DNA分子。,生物芯片分析过程,生物芯片技术的应用 applications of biochip technology,1. 1998 年底美国科学促进会将基因芯片技术列为 1998 年度自然科学领域十大进展之一，足见其在科学史上的意义。,基因芯片作为一种先进的、大规模、高通量检测技术，应用于疾病的诊断，其优点有以下几个方面：,一是高度的灵敏性和准确性； 二是快速简便； 三是可同时检测多种疾病。 如应用于产前遗传性疾病检查，抽取少许羊水就可以检测出胎儿是否患有遗传性疾病，同时鉴别的疾病可以达到数十种甚至数百种，这
11、是其他方法所无法替代的，非常有助于“优生优育”这一国策的实施。,又如对病原微生物感染诊断，目前的实验室诊断技术所需的时间比较长，检查也不全面，医生往往只能根据临床经验做出诊断，降低了诊断的准确率，如果在检查中应用基因芯片技术，医生在短时间内就能知道病人是哪种病原微生物感染；而且能测定病原体是否产生耐药性、对哪种抗生素产生耐药性、对哪种抗生素敏感等等，这样医生就能有的放矢地制定科学的治疗方案；,生物芯片技术的应用,再如对具有高血压、糖尿病等疾病家族史的高危人群普查、接触毒化物质人群恶性肿瘤普查等等，如采用了基因芯片技术，立即就能得到可靠的结果，其他对心血管疾病、神经系统疾病、内分泌系统疾病、免疫
12、性疾病、代谢性疾病等，如采用了基因芯片技术，其早期诊断率将大大提高，而误诊率会大大降低，同时有利于医生综合地了解各个系统的疾病状况,第二节 目的基因制备技术,Molecular Biology,生命科学技术系细胞生物及遗传学教研室,一、PCR技术,PCR技术：是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。它可以在试管中建立反应，经数小时之后，就能将极微量的目的基因或某一特定的DNA片段扩增数十万乃至千百万倍。经n次扩增后, 一个DNA分子可变为2n个DNA分子。其中目的片断为2n-2n，非目的片断为2n。,聚合酶链式反应 (Polymerase Chain Reaction , PCR),M
13、olecular Biology,生命科学技术系细胞生物及遗传学教研室,PCR技术的创建,Kary B. Mullis（穆利斯（美）,Khorana(1971)等提出在体外 经DNA变性,与适当引物杂交,再用 DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。 1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术 ；1989年美国Science杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。,Molecular Biology,生命科学技术系细胞生物及遗传学
14、教研室,OUTLINE,3 concepts 5 Essential Components 3 steps One sentence,Molecular Biology,生命科学技术系细胞生物及遗传学教研室,3 Concepts of the PCR,Denaturation : 变性Renaturation：复性3. Semiconservative replication：半保留复制,the double strand DNA open to single stranded DNA,two single stranded DNA form double strand DNA,replica
15、tion, one make two,Molecular Biology,生命科学技术系细胞生物及遗传学教研室,Semi-conservative replication,Molecular Biology,生命科学技术系细胞生物及遗传学教研室,5 Essential Components of PCR Reaction,Molecular Biology,生命科学技术系细胞生物及遗传学教研室,Taq DNA Polymerase,Taq : Thermus aquaticus,2. 95,T1/2(half life) 40min,3. Polymerization,Molecular Bi
16、ology,生命科学技术系细胞生物及遗传学教研室,Polymerization 聚合反应,Taq Polymerase,dT,5 ,3 ,3 ,5 ,A,Taq polymerase: 72, 2,0004,000 bases/min,Molecular Biology,生命科学技术系细胞生物及遗传学教研室,three steps:,How PCR works,Denaturation (变性): 9097,Annealing (退火): 4555,Extension (延伸): around 72,Molecular Biology,生命科学技术系细胞生物及遗传学教研室,TGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGAT,
