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1、李国富,,神奇的结构生物学,liguofu,1,生物大分子结构与生命奥秘 e.g.1:ATPase e.g.2:dsDNA病毒DNA的包装马达 e.g.3:Influenza 的结构与医疗,Outline,什么是结构生物学,生物大分子结构测定的方法 主要方法简介 进展评价,liguofu,2,ATPase 以膜两侧的H差为能量合成ATP,ADP + Pi ATP + H2O,e.g.1,ATPase 存在于线粒体内膜、叶绿体类囊体膜（和细菌质膜）上,liguofu,3,e.g.1,liguofu,4,ATPase 象一台水力发电机,e.g.1,liguofu,5,Asp or Glu,Arg,
2、ATPase的转动机构/原理 (4),e.g.1,liguofu,6,水轮机,e.g.1,liguofu,7,ATP合成过程,e.g.1,liguofu,8,e.g.2,线性双链DNA（ds DNA）病毒，包括噬菌体、腺病毒、 痘病毒、疱疹病毒等，在成熟过程中都有一个将自己的基因组DNA转运到蛋白质衣壳（procapsid ）中的包装机制。这一包装机制由ATP驱动的DNA包装马达完成，可以将DNA压缩到接近晶体的密度。目前研究的最深入和最广泛的是Phi29噬菌体的DNA包装马达,liguofu,9,e.g.2,liguofu,10,e.g.2,liguofu,11,e.g.2,liguofu,
3、12,e.g.2,liguofu,13,e.g.2,liguofu,14,e.g.2,liguofu,15,三类主要感冒病毒,感冒病毒偏好寄生于呼吸道上皮细胞: Influenza Virus A 引起流行性感冒, 感染许多哺乳动物 Influenza Virus B 只感染人, 引起的症状较轻 Influenza Virus C 只感染人, 一般认为没有什么危害. 该型在遗传组成与形态上也与A型和B型不同,e.g.3,liguofu,16,感冒病毒结构模式图,血凝素(HA)与呼吸道上皮细胞表面的粘蛋白结合, 介导病毒对寄主细胞的感染,神经氨酸苷酶(NA),8个,e.g.3,liguofu,1
4、7,感冒病毒引起的免疫反应（）,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y:抗体,e.g.3,liguofu,18,Macrophage 巨噬细胞,感冒病毒引起的免疫反应（）,e.g.3,liguofu,19,Vaccines,Drugs,感冒的治疗,e.g.3,liguofu,20,为什么人会不断感冒/每年都要用新疫苗预防?,Influenza alters its HA and NA all the time! Memory B cells cant recognize it anymore,e.g.3,liguofu,21,Small Changes
5、= Drift,感冒病毒表面蛋白(抗原HA/NA)的改变,Big Changes = Shift,e.g.3,liguofu,22,感冒病毒的复制,e.g.3,liguofu,23,成熟的病毒以出芽方式出现在寄主细胞表面,但通过HA与细胞膜糖脂结合被固定在寄主细胞上，NA的作用是切割神经氨酸苷键，使病毒得以释放，感染其他细胞,e.g.3,唾液酸,liguofu,24,Active site in pocket,Inhibitor,NA的活性位点在一个pocket 中，非常保守，为小分子药物治疗提供了靶点但抗体分子大，不能进入此位点，因此研制永久性疫苗仍然是困难的,e.g.3,liguofu,2
6、5,DANA：唾液酸的类似物，对Influenza的NA有抑制作用，但特异性差，也能抑制动物的NA,e.g.3,liguofu,26,Scientific name: zanamivir（扎那米韦）Trade name: Relenza (瑞乐沙, 乐感清),由英国伦敦葛兰素史克公司研制，对Influenza的NA有很好的选择性，但由于极性很强，不易穿越膜脂障碍到达呼吸道上皮细胞，但通过气雾或喷洒给药，可使疗效极大增强,liguofu,27,Scientific name: Oseltamivir (奥司他韦 ) Trade name: Tamiflu (大陆称“达菲”,香港称“特敏福”，台湾
7、称“克流感” ),由罗氏（Roche）公司，全称Hoffmann-La Roche，总部位于瑞士巴塞尔,liguofu,28,生物大分子结构与生命奥秘 e.g.1:ATPase e.g.2:dsDNA病毒DNA的包装马达 e.g.3:Influenza 的结构与医疗,Outline,什么是结构生物学,生物大分子结构测定的方法 主要方法简介 进展评价,liguofu,29,结构生物学是以生物大分子特定空间结构、结构的特定运动与生物学功能的关系为基础，来阐明生命现象极其应用的科学.,1. 结构生物学的概念,liguofu,30,结构生物学,以结构为基础的功能阐述（目的）,2.结构生物学的内容,li
8、guofu,31,静态结构晶体衍射 X-ray衍射 中子衍射 电子衍射透射电镜核磁共振(NMR) ,结构生物学的技术方法,结构变化 园二色光谱 (CD) 红外/拉曼光谱 荧光光谱 差示量然分析 (DSC) 电子顺磁共振 (EPR) 核磁共振(NMR) 原子力显微镜 (AFM) ,http:/www.rcsb.org/pdb/home/home.do,liguofu,32,Outline,生物大分子结构测定的方法 主要方法简介 进展评价,生物大分子结构与生命奥秘 e.g.1:ATPase e.g.2:dsDNA病毒DNA的包装马达 e.g.3:Influenza 的结构与医疗,什么是结构生物学,
9、liguofu,33,主要结构测定方法简介,X射线晶体学 核磁共振 (NMR) 透射电镜,liguofu,34,X射线晶体学的流程,晶体生长,晶体衍射,母晶 晶体重金属衍生物,傅里叶合成,电子密度图,晶胞参数 衍射强度和相位,两套以上不同 的衍射数据,根据结构模 型修正相位,碳骨架走向 氨基酸残基指认,结构模型,衍射强度 修正后的相位,liguofu,35,Start with very pure protein Create a supersaturated the solution Wait,How do you grow crystals?,liguofu,36,Diffraction,
10、This X-ray diffraction pattern of a DNA-cleaving enzyme was imaged at the facility by the Barry Stoddard group from the Fred Hutchinson Cancer Research Center,liguofu,37,电子密度图（electron density map）,分 辨 率的重要性,1 resolution,6 resolution,1.0 ：可分辩单个原子（N比C大） 2.5 ：可分辨环状状结构 3.0 ：不易可分辨环状状结构 4.0 ：很难确定是否环状结构.,
11、6.0 ：可分辨 a helix，不能分辨b sheet 8 ：只能分辨分子,liguofu,38,1.5 Angstrom resolution,liguofu,39,自旋量子数 I 不为零的核的自旋运动将产生磁矩,核磁共振的研究对象为具有磁矩的核。 原子核可按 I 的数值分为以下三类 中子数、质子数均为偶数，I =0，如12C、 16O、32S（没有核磁共振现象） 中子数与质子数其一为偶数，另一为奇数，则I为半整数（I1/2; 3/2)，如1H、13C、15N、19F、31P 中子数、质子数均为奇数，则I为整数，如2H、14N（I =1）,核的自旋,NMR,liguofu,40,For I
12、 = nuclei have two spin states,M = -1/2,M = +1/2,The energy gap between states is small and corresponds to radio frequency waves,E = h ,核磁共振的产生,NMR,liguofu,41,liguofu,42,NMR,NMR Spectroscopy,由NMR得到的结构参数,化学位移：电子对核自旋的屏蔽作用 原子核在分子中的位置 自旋耦合：核自旋间的相互作用 原子核之间的键合关系 化学键之间的夹角二面角 NOE效应: 核的空间距离 弛豫速率：核自旋间能量交换 原子核
13、之间的距离 分子运动的相关时间 分子链段的柔性，及其势垒,NMR,liguofu,43,主要结构测定方法简介,X-ray衍射 核磁共振 (NMR) 透射电镜,liguofu,44,电镜原理,liguofu,45,结构测定使用的是透射电镜 (TEM),还有一种电镜称为扫描电镜 (SEM),可以获得被观察对象的表面形貌信息.,透射电镜外观,liguofu,46,TEM,原理(从很多张平面照片中构建立体结构),liguofu,47,总结/述评,X-ray Crystallography是目前最主要的研究生物大分子结构的手段,分辨率可以达到原子水平. 原则来说, 它没有分子大小的限制, 但由于需要得到
14、好的晶体才能解析晶体结构, 太大的分子复合体不易得到结晶, 目前还是有一定限制. 同步辐射光源的应用提高了X-ray的衍射质量. 样品的结晶是一个瓶颈, 尤其是膜蛋白的结晶很难得到,因此,结晶方法的研究仍是努力的方向. 得到好的相角解决办法也是值得努力的方向. 该方法的另一个缺陷是它只能给出研究对象的一个静态结构.,liguofu,48,NMR是目前仅次于X-ray Crystallography的研究生物大分子结构的手段, 也具有很高的分辨率. 它的样品为溶液状态, 不需要结晶, 这是一个优点. 但由于大分子的NMR谱非常复杂, 虽然提高外磁场强度, 解谱方法从一维发展到二维和三维 都能使分
15、辨率得到提高, 该方法的应用还是受到分子大小的限制, 目前底分辨率下分子量可达50kDa左右, 高分辨率下分子量可达30kDa左右.,liguofu,49,TEM对样品的要求较低, 对非晶体状态的分子（不能使用Xray衍射），难溶的纤维状堆积体（如导致疯牛病的朊蛋白(prion),导致老性痴呆症的淀粉样蛋白等几乎不可能培养晶体, 也很难获得均匀的溶液而不能使用NMR）都可使用TEM手段进行结构测定， 而且，TEM处理的对象尺度没有上限，因此，TEM适用分子复合体系和超分子复合体系（如核糖体、噬菌体和病毒颗粒等）。理论上这种方法也具有原子水平的分辨率, 但由于实际上的技术困难, 目前的分辨率与X
16、-ray和NMR比还有一定差距。,liguofu,50,低温对于提高Xray晶体衍射、NMR和TEM的分辨率都具有重要的作用。NMR现在发展了低温探头，TEM现在流行的做法成为冷冻电镜（cryo-EM）。冷冻电镜的含义不仅仅指拍照时在低温状态，更指样品的制备在冷冻条件下进行（比液氮还低的乙烷，-150摄氏度）。冷冻电镜的显著优点在于将样品保持在水相中快速冷冻, 保持天然状态；第二点是可以得到高分辨率结构; 第三是可将分子在不同状态下冻结, 可以捕捉到过渡状态；第四是观察超分子体系。,liguofu,51,冷冻电镜（cryo-EM）与X-ray晶体衍射和NMR的结合, 就可以解析复杂体系结构。 cryo-EM可以为超分子复合体系提供一个中等分辨率的框架，然后用X-ray晶体衍射/NMR解析每个组分的高分变率结构，最后将高分变率的各组分按照cryo-EM提供的框架进行对接，得到超分子体系的结构。这是未来结构生物学的方向,
