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1、临床分子生物学诊断进展,陈鸣 教授 主任医师 第三军医大学第三附属医院检验科 023-68757601，,OUTLINE,测序技术 乙肝病毒耐药突变检测 预测某些疾病的遗传风险程度 肿瘤化疗药物敏感试验,生物芯片技术 固相芯片 液相芯片,基因组和分子检测： 生物芯片技术,DNA 芯片,cDNA芯片,Oligo芯片,信息 生物芯片,多肽芯片,生物 芯片,微流体芯片,功能 生物芯片,芯片实验室,组织芯片,蛋白芯片,抗体芯片,蛋白质芯片,SAGE/CAGE,epigenetics芯片,质粒microarray,微株array,基因组 genetics,转录组 mRNA,Introduction,“S
2、cience”: Foder提出基因芯片概念 1991 第一张基因芯片：美国Affymetrix公司 1992 第一张以玻璃为载体的基因芯片： Stanford大学PBrown实验室，1995 “Science”: Schena 基因表达谱的研究，1995 第一张实用型基因芯片：Affymetrix 1996 中国科学界第一次专项讨论：第80次“香山科学会议”上， 1997年9月 1998年度自然科学领域十大进展之一 美国正式启动基因芯片计划：1998 “生物芯片技术”正式列入国家“863”计划 ：1999,Sample DNA,Each spot contains known DNA,Bio
3、chip,Complementary DNA hybridize,Signal appears,Biochip Based on Hybridization,7,我国残疾人口有8296万，其中耳聋残疾人群占2004万，占24%，累及2.6亿家庭人口。,耳聋人群,2006年第二次全国残疾人抽样调查数据,8,耳 聋 的 致 病 因 素,9,中国人群遗传性耳聋的特点,遗传性耳聋突变位点具有明显的种族差异 中国人群大部分遗传性耳聋由4个基因的突变所引起：GJB2、 GJB3、 SLC26A4（PDS）、mtDNA 12s rRNA等 中国人群的耳聋突变热点： GJB2：35 del G，176 del
4、 16，235 del G，299 del AT SLC26A4（PDS）：IVS7-2 AG，2168 AG GJB3：538CT 线粒体：12S rRNA：1555 AG，1494 CT,10,基因型与临床表型的对应关系,线粒体基因 C1494T、A1555G突变： 氨基糖甙类药物敏感性耳聋GJB2基因： 先天性重度以上感音神经性耳聋PDS基因： 大前庭导水管综合征（EVAS）一种内耳畸形，先天或后天重度以上感音神经性耳聋GJB3： 后天高频感音神经性耳聋,11,遗传性耳聋的遗传特点,父母均为健康携带者,12,耳聋基因检测的价值,尽量避免两个同一基因纯合突变的聋人结婚！,针对聋人群体：,1
5、3,耳聋基因检测的价值,基因检测可指导聋人的婚配，避免婚后再生聋儿！,针对聋人群体：,14,现有位点可覆盖中国人群中 98%GJB2, 80%PDS, 90%药物性耳聋患者,遗传性耳聋检测试剂盒包括的基因位点,晶芯遗传性耳聋基因检测试剂盒,标本采集 3管EDTA抗凝的紫头管（最好空腹）,16,遗传性耳聋检测芯片的检测结果,235 杂合,1555均质,IVS 杂合,2168和IVS复合杂合,2168 纯合,Wild Type,Control,可对四个基因9个位点的基因型进行准确检测，报告野生、杂合突变或纯合突变等三种结果,QC BC PC,PC NC QC,35W IC35 538W,35M I
6、CG3 538M,176W 1494W PC,176M 1494M BC,235W 1555W 2168W,235M 1555M 2168M,299W ICmt IVSW,299M IC21 IVSM,ICG2 BC ICIVS,检测意义,GJB2基因先天性耳聋基因：当GJB2基因发生突变时，患者出生即表现出耳聋症状检测意义：为耳聋患者确诊病因；指导生育有聋儿的家庭再次生育；筛查有耳聋家族史的家庭成员的基因突变情况；等,线粒体12s rRNA基因药毒性耳聋致病基因：当该基因发生突变时，患者听力正常，但当使用氨基糖甙类药物时，就会导致重度耳聋的发生检测意义：通过检测此基因，可以明确被检者该基因突
7、变情况，指导患者用药 ；明确患者家庭中该疾病的遗传性,19,GJB3基因后天性耳聋基因：当GJB3基因发生突变时，患者青少年时期听力正常，当发育至青壮年期间（2030岁）时，听力逐渐下降，直至发生重度耳聋检测意义：通过检测此基因，可以为听力下降的患者明确病因；指导生育有聋病患者的家庭再次生育；筛查有耳聋家族史的家庭成员的基因突变情况,SLC26A4（PDS）基因大前庭导水管综合征致病基因：当PDS基因发生突变时，患者出生时耳蜗发生畸变，但不发生耳聋症状，当患者患感冒、头部受打击时，听力逐渐下降，直至发生重度耳聋检测意义：通过检测此基因，可以为听力下降的患者明确病因；指导患者生活习惯，指导生育有
8、聋病患者的家庭再次生育；筛查有耳聋家族史的家庭成员的基因突变情况,实例介绍1,22,样本由杭州惠耳听力提供,实例介绍2,23,样本由中国聋康中心提供,实例介绍3,24,父亲：野生型；聋儿,母亲：野生型；聋儿,孩子： 野生型；听力正常,样本由大坪医院提供,Luminex 200TM多功能流式点阵仪,液态芯片是基于Luminex200TM（美国Luminex公司）的是一个多功能生物芯片平台，既能检测蛋白、又能检测核酸的高通量技术平台 通常用于免疫分析、核酸分析、受体和配体分析等临床检测和科学研究 LuminexTM有机地整合了编码微球、激光技术、应用流体学、最新的高速数字信号和计算机运用法则，具有
9、很高的检测特异性和灵敏度,Luminex200TM,Luminex xMAP Technology - 1,http:/,Luminex xMAP Technology - 2,Luminex xMAP Technology - 2,42,6,33,18,52,58,16,HPV DNA分型检测液芯操作配套设备,30-40min,2.5hr,15min,采样刷、细胞保存液、冰箱,离心机（10000rpm）、TIP头（大、中、小）、EP管、水浴锅、金属加热器、移液器（1000l、200l）、手套、口罩,PCR仪（非荧光）、TIP头（大、中、小）、PCR管、PCR实验室,流式荧光仪（ Lumine
10、x200TM）、电脑,PCR仪（非荧光）、TIP头（大、中、小）、PCR管,液芯HPV DNA分型产品三大优势,激光分析，数字结果无需洗涤，减少污染液相杂交，重复性好,液相杂交，效率高、重复性好,固态芯片产品：膜条式反向杂交，基质不均一，温控困难，重复性差,液芯产品：液相杂交，反应彻底，温控严格，重复性好,Solid-Phase Kinetics,Solution-Phase Kinetics,已获SFDA药证的项目,HPV分型（高危、低危型，同时检测26种压型） 肿瘤标志物（13种） 自身免疫性疾病的诊断标记物,OUTLINE,测序技术 乙肝病毒耐药突变检测 预测某些疾病的遗传风险程度 肿瘤
11、化疗药物敏感试验,生物芯片技术 固相芯片 液相芯片,人类基因组计划 The Human Genome Project,1985: 提出对整个人类基因组DNA测序 1990: 国际合作项目，历时13年 花费： $3 Billion,人类基因组计划 The Human Genome Project,人类基因组计划 The Human Genome Project,Now we run our products on gel,双脱氧荧光测序方法,vs.,电泳和数据的产生:,全自动测序方法 Automated Sequencing,测序技术的飞跃,2003年，“HGP”获得首张人类全基因组图谱，花费了
12、30亿美元和13年的时间 Craig Venter开发出一种快速追踪测序方法，并于2007年9月完成Venter自身全基因组的测定工作，花费了大约1亿美元,Bad boy of Science,测序技术的飞跃,2008.4.17Nature杂志上， 454测序新技术：美国454 Life Sciences公司，花了150万美元，4个月 Illumina genome analyzer Applied Biosystems SOLiD sequencer,454 sequencing： Emulsion PCR (emPCR),Mix DNA Library& capture beads (li
13、mited dilution),Create “Water-in-oil” emulsion,+ PCR Reagents,+ Emulsion Oil,Perform emulsion PCR,Adapter carrying library DNA,A,B,Micro-reactors,Adapter complement,Load beads into PicoTiter Plate,Load Enzyme Beads,2018/9/13,50,测序技术的飞跃,Helicos公司开发的HeliScope Sequencer “单分子测序” 不需要PCR扩增 成本最低 目标：10万美元，3
14、个工作日左右 一个重要的里程碑 在联系个人化基因组和个人化治疗方面 破解生命密码并找到缺陷基因 对于各种遗传疾病、癌症、肥胖等具有难以估量的意义,测序技术在临床上的应用,肝炎病毒变异、分型的检测（HBV ） 预测某些疾病的遗传风险程度（乳腺癌、结肠癌） 个体化用药指导 （肿瘤化疗用药指导）,肝炎病毒变异、分型的检测（HBV ）,核苷类药物,干扰素,耐药突变点检测,LAM,ADV,ETV,C基因区变异,与肝脏疾病的严重程度有关与抗病毒治疗的效应与肝癌栓塞治疗的效应,HBV基因分型,可在耐药临床表现发生前14个月检测出突变株 适时调整用药方案,存在着天然耐药株,HBV DNA 阳性,乳腺癌( br
15、east cancer),发生于乳腺导管上皮细胞的恶性肿瘤是女性常见的肿瘤之一,约占全身恶性肿瘤的7 % - 10% 全世界每年新发乳腺癌约150 万例,死亡约57 万例,Genetics,BRCA-1 BRCA-2 P53, Rb-1 Her-2/neu, c-erB2, c-myc,BRCA1、BRCA2基因突变与乳腺癌,通过对有乳腺癌家族史妇女的BRCA1和BRCA2基因突变的检测显示,此类人群中约有10%为BRCA1和BRCA2基因突变的携带者。BRCA1和BRCA2基因突变的携带者到70岁时,发生乳腺癌的风险累计达到80%-85% ,一生中发生乳腺癌的风险可高达90%BRCA1和BRCA2基因突变的检测是对于有乳腺癌家族史人群进行乳腺癌筛查和早期诊断的有效方法,What can YOU do?,1.一侧乳腺癌 2.乳腺肿块 3.有家族史 4.肿瘤标记物,每个人是不同的 大多数病人的治疗方案是相同的 医药费: 数以万计的钱花在没有疗效的药物治疗 死亡/病重: 2.2 亿严重的病例和超过100万的死亡例数,最大的挑战: 药物个体反应的差异,相同药物，相同药效？,相同临床表现 相同实验室检查结果 相同疾病 (?),相同药物.,不同的疗效,?,不同的遗传背景,
