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1、武汉科技学院 毕业设计论文1精品 1灿烂绿分光光度法测量微量肝素钠的研究灿烂绿分光光度法测量微量肝素钠的研究Spectrophotometric Determination of Trace Heparin with Brilliant Green摘要摘要在 pH=7.0 的 Britton-Robinson 缓冲溶液中 ,肝素钠与灿烂绿相互作用形成离子缔合物而导致溶液吸收光谱发生变化，染料发生明显的褪色 ,灿烂绿溶液在 625nm 处有一个强的特征吸收峰，加入肝素钠以后，吸收峰降低，且没有新的吸收峰出现，体系吸光度的降低与肝素钠浓度成正比 。对结合反应的条件进行了优化 , 在最佳条件下利用溶
2、液吸光度值与肝素钠浓度的关系建立了一种测定肝素钠浓度的新方法，体系吸光度与肝素钠在 160 - 440 g 范围成线性，线性范围较宽，且线性较好，相关系数为 0.995。分光光度法具有较高的灵敏度和选择性，结果满意，可用于微量肝素钠的定量分析。关键词：关键词：分光光度法; 肝素钠; 灿烂绿，定量测定ABSTRACTABSTRACTABSTRACTA new Spectrophotometric method for the determination of trace heparin (摘要翻译完再传给我看看，以免出错，学校对摘要审查较严格。) Keyword: Spectrophotomet
3、ric; Heparin; Brilliant Green，Quantitative determination武汉科技学院 毕业设计论文1精品 2从目录看， “3 紫外分光光度计”部分内容太多（9-13 页，最多只能半页，所以需要全部删掉）请补充其他内容，以保证全文 1 万 5 千字（学校要求） 。目 录1 引言42 肝素钠.52 .1 肝素钠的化学组成与性质62.2 肝素钠的医疗价值.62.3 肝素钠的研究与进展.72.4 肝素钠的抗凝血机理72.5 低分子肝素钠产品的开发.83 紫外分光光度计.93.1 光的基本知识.93.2 光的吸收定律-朗伯-比尔定律93.3 吸收光谱原理.103.
4、4 分光光度计的构造原理.113.4.1 光源.113.4.2 单色器.113.4.3 狭缝123.4.4 比色杯123.4.5 检测器系统123.5 分光光度技术的基本应用13武汉科技学院 毕业设计论文1精品 33.5.1 测定溶液中物质的含量133.5.2 用紫外光谱鉴定化合物134 试验部分.144.1 仪器和试剂.144.2 实验方法.145 结果与讨论.145.1 吸收光谱图.145.2 灿烂绿浓度与吸光度关系曲线.155.3 灿烂绿与肝素钠络合后样品的吸收光谱.165.4 显色剂用量的影响.175.5 缓冲溶液 pH 的影响及缓冲溶液用量的影响175.6 线性范围及标准曲线.185
5、.7 反应时间与吸光度的稳定性.196.结束语.16.16.16武汉科技学院 毕业设计论文1精品 41 引言：引言：肝素钠,通常是指肝素及其盐类药品 (如肝素钠，Sodium Heparin ) ,其化学成分是一种由动物结缔组织肥大细胞合成的黏多糖 ,在医学上是一种天然抗凝血物质。肝素是我国近年来生化药类出口三大当家产品 (氨基酸类、肝素类、软骨素类 ) 之一。利用动物资源提取肝素类可说是一个古老的话题 ,早在 1916 年美国麦克伦 (Mcleen)在研究凝血问题中 ,成功地从狗的肝脏提取了肝素 ,随后 40 年，可以说是长期应用、经久不衰。由于肝素分子量难以固定 ,所以无法人工合成 。肝素
6、钠的含量测定常用的是生物方法，受生物个体的影响较大，稳定性不好。此外，分光光度法、高效液相色谱法、毛细管电泳法、电化学传感器也应用于肝素钠的测定。分光光度法由于具有操作简单，快速、仪器价廉、灵敏度较高的优点而得到广泛的应用。因此进一步研究灵敏度高、选择性好的新分光光度法有重要的意义。本文采用灿烂绿为光度试剂，灿烂绿（Brilliant Green, BG），即 N-4-(4-二乙氨基)苯基苯基亚甲基-2，5-环已二烯-1-基亚基-N-乙基乙铵硫酸盐（11） ，是一种阳离子染料，结构如图 1 所示。在 pH 9.0 的 Britton-Ronbinson缓冲溶液中，利用它与肝素钠的相互结合导致溶
7、液褪色的现象，建立了一种分光光度法测定肝素钠的新方法，优化了测定条件，建立了测定肝素钠的工作曲线，结果令人满意。CNNSOOOHOOO COOH OHOSO3OOOHCH2OSO3NHSO3图 1 灿烂绿结构 图 2 肝素钠重复单元Fig.1 Structure of brilliant green Fig.2 Repeating unit of heparin武汉科技学院 毕业设计论文1精品 52 肝素钠肝素钠2 .1 肝素钠的化学组成与性质肝素钠的化学组成与性质肝素钠结构如图 2 所示。蛋白多糖是生命体的重要组成部分，广泛存在于生物体的细胞内外机制？中，具有许多生理功能。肝素钠为糖胺聚糖，
8、是蛋白多糖的一种，它是由葡萄糖胺磺酸、葡萄糖磺酸。艾杜糖醛酸等通过糖苷键连接而成的重复二糖单元组成的线性链状分子，平均相对分子量为 12000Da。肝素类为白色或灰白色粉末 ,无臭无味 ,有吸湿性,钠盐易溶于水 ,不溶于乙醇、丙酮、二氧六环等有机溶剂。肝素为趋于螺旋形的纤维分子,与其黏多糖相比 ,其特性粘度较小,为 0. 10. 2。肝素在 185220 nm 波长处有特征吸收 ,在230300 nm 波长处无光吸收。由于硫酸基和羧酸基的存在，肝素钠带负电荷，在水溶液中由于其酸性基团的解离而成为带多个负电荷的大阴离子。肝素钠不论在体内或体外，都有迅速的抗凝血作用 ，主要作用于纤维蛋白的形成，它
9、在人体由肥大细胞分泌而自然存在于血液之中，其作用原理是肝素钠能强化血浆中抗凝血酶（AT）的作用，AT与凝血酶相结合，形成 AT凝血酶复合物而使酶灭活，防止血小板的聚集和破坏。肝素钠可用于预防和治疗血栓栓塞性疾病，如：心肌梗塞、肺栓塞、脑血管栓塞、外周静脉血栓等，可防止血栓的形成和扩大。 目前在心血管和血栓病人中，是一种天然抗凝血药 。对不同的疾病具有不同的最适用量， 静脉或深部肌注，或皮下注射每次500010000 单位，用量过大时可引起自发性出血，如：粘膜出血、关节积血、伤口出血等 ，临床上需进行监控，因此对肝素钠的定量测定具有非常重要的意义。2.2 肝素钠的医疗价值肝素钠的医疗价值肝素钠最
10、早是从动物的肝脏中提取所得，故以名之。目前世界各国均从猪或牛羊的肠粘膜中提取、是医学临床用量最大的抗凝血药。早在上世纪40 年代初，西方研究人员即已发现肝素钠具有很强的抗凝血作用。直到武汉科技学院 毕业设计论文1精品 620 世纪 90 年代，临床治疗深度静脉血栓和肺栓塞等血栓病几乎还是完全依赖肝素钠。低分子肝素钠是一类平均分子量为 5 kD 的肝素钠， 临床应用的LMWH（低分子肝素钠）是由 UFH（中文名？）经化学或酶解方法制备的钠盐或钙盐是一种升级产品。 1976 年 Johnson 等发现皮下注射低分子肝素时，在体内抗 FXa 的作用要比普通肝素钠强得多，从此低分子肝素钠的开发与研究越
11、来越被重视，成为国内外肝素钠研究的热点。低分子肝素钠保留了普通肝素抗血栓形成等功能，减轻或避免了普通肝素钠的不良作用，使用起来更方便。我国自 20 世纪 90 年代已开始低分子肝素钠产品的研制。2.3 肝素钠的抗凝血机理肝素钠的抗凝血机理肝素钠抑制血液凝固的功能是多方面的，目前医学界普遍认为肝素钠的抗凝血机制与抗凝因子(AT-，又称肝素协同因子)密切相关。AT-是一种单链糖蛋白酶，可与凝血酶原结合，抑制凝血的发生。在这一过程中 AT-必须发生一个构象的变化，而这是一个相对缓慢的过程。肝素在和 AT-发生络合后，则可大大降低 AT-构象变化的自由能，加快抗凝血进程。在这一络合过程中，肝素钠作为一
12、种生物活性物质，其构型、构象变化显然十分重要。肝素钠也能抑制因子 V,VI,IX 及 VIII 在血液凝固的级联反应时的激活44,45，能被肝素改变活性的酶已达 50 余种。肝素钠对酶活性的抑制都是通过和它们生成络合物而改变它们原有的构象这个基本过程来实现的。肝素钠的抗凝血活性在很大程度上依赖于沿糖链官能基的分配形式和数量。例如，游离氨基含量越多，肝素钠的抗凝血性越好。有数据表明，当超过一半 N-硫酞基脱硫或成为游离氨基，肝素钠的活性就消失;而 50%的 O-硫酞基或 10-20经基的脱去不会使肝素失活。有人在高分子材料表面引人与肝素相似的基团，如磺酸基、羧基等，以期望得到类似肝素的抗凝血效果
13、。结果发现，表面磺酸基含量大的材料确实有一定的抗凝血性，且此抗凝血性与磺酸基连接到表面的链长有关。武汉科技学院 毕业设计论文1精品 72.4 肝素钠的研究与进展肝素钠的研究与进展（此段不要，改写成与本论文有关的肝素（此段不要，改写成与本论文有关的肝素钠含量测定分析方法方面的研究与进展）钠含量测定分析方法方面的研究与进展）我国对肝素类产品研究与开发大多集中在五个方面 ,即 (1)提取工艺改善; (2)低分子肝素开发； (3)效价评定科学化 ; (4)各种制剂类型开发 ; (5)临床医学应用等。下面简述与肉类企业密切相关的内容。2.4.1 肝素类提取工艺的改善据技术文献 ,以我国学者李良铸、李明晔
14、编著 最新生化药物制备技术 (2001 年 )对肝素类提取工艺较为详尽和全面。主要介绍的提取工艺有: (1) 酶解 树脂分离法 ; (2)盐解 树脂分离法 ; (3) CTAB法 (即十六烷基三甲基溴化胺法 ); (4)法国 Pharmuka 公司提取法 ; (5)牛肺提取肝素法 ; (6)以粗品肝素钠为原料制备肝素钙 (精品 )法。此后许多文献资料所阐述的肝素类提取的技术路线、工艺过程和关键技术等都没有超越该书范畴。例如我国学者褚庆环主编 动物性食品副产品加工技术 (2005 年) ,是我国近年来一本较新的科技读物。该书总结归纳了肝素提取两种方法 ,即 (1)盐解 离子交换盐法 ; (2)酶
15、解 离子交换法。我国学者孔保华 (东北农业大学 )在主编畜产品加工储藏新技术 一书中，除阐述了肝素类提取原理与方法外 ,还阐述了影响肝素提取的主要因素 ,主要有: (1)肠粘膜新鲜度是肝素类提取的基本保障。 (2)提取肝素所用有关助剂 (辅料 )如用水、盐、乙醇的纯度必须注意。 (3)对交换吸附树脂的选型 ,以及在使用前、使用中和使用后对树脂的处理不可疏忽。树脂用量约为肠粘膜质量的 5%,用量大会成本高 ,用量小导致吸附效果差，树脂交换吸附的温度为 3050,洗脱时温度为 2030。若温度过低 ,则肝素活性降低不利于交换吸附和洗脱 ,若温度过高将影响肝素和树脂的稳定性。 (4)工艺操作须严格按
16、规程执行 ,如对洗涤用盐水浓度的选择必须在 23 mol/L,否则难以洗涤去除杂质、会降低肝素纯度和效价。盐解温度不宜超过 55,否则肝素与蛋白质难以分离 ,甚至使部分肝素凝固在蛋白质中。盐解后有一个短暂升温到98,是为了进一步促进肝素与蛋白质分离 ,但时间不宜过久等。武汉科技学院 毕业设计论文1精品 82.5 低分子肝素钠产品的开发低分子肝素钠产品的开发（此段不要，因为与本论文肝素钠含（此段不要，因为与本论文肝素钠含量测定分析方法的相关性不大）量测定分析方法的相关性不大）我国最早的低分子肝素钠制剂是 1985 年大连生化制药厂开发的 “抗栓灵含片 ”。以后相继有多个厂家研发、生产低分子肝素类药
