糖连接位置的测定课件

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1、,（四）糖连接位置的测定 1、化学方法：多采用甲基化法首先将糖链全甲基化，然后水解所有的苷 键，用气相色谱法对水解产物甲基化单糖 进行定性和定量分析。 定性分析：需要选择各种单糖的标准品 计算各甲基化产物相互之间的比例，推测糖 链重复单位中各种单糖的数目,全甲基化 水解,2、NMR谱法 13CNMR谱法：是目前用来确定糖的连接 位置的常用方法 该法是在归属各碳信号的基础上，以游离苷元和甲基糖苷作为参考化合物，确定产生苷化位移的碳，然后利用苷化位移规则，即可方便地获知各单糖的连接位置。, 1HNMR谱法：首先是使糖与苷先乙酰化，接着比较不同类型质子的化学位移值。例如：CHOAc中CH质子的化学位

2、移为4.755.4 ppm; 而CH2OAc、CH2OR中质子的化学位移在3.04.3ppm；端基质子的化学位移介于这两者之间。最后通过2D-NMR就可判定质子的归属，从而得出糖的连接位点。,（五）糖链连接顺序的决定 1、经典方法：部分水解法 过程： 多糖 部分水解 低聚糖 分析低聚糖连接顺序 推测糖链连接顺序 2、驰豫时间法 基本原理：外侧糖的自旋晶格驰豫时间T1 比内侧大，同一糖上各碳的自旋晶格驰豫时间 T1则基本相同。,3、质谱分析法 先了解糖的组成，再根据质谱裂解规律和化合物的裂解碎片推测低聚糖及其苷中糖链的连接顺序。 可解决低聚糖及其苷中糖链的连接顺序，但难于准确确定糖链的连接位置。

3、 要求低聚糖及其苷中的糖不能是同一类糖。,4、现代方法：NMR与2D-NMR法在归属各个碳原子与H原子信号的基础上， 利用HMBC（异核多键相关）、NOESY （二维NOE谱）等波谱技术，通过观察相连 碳氢或HH远程偶合，推断糖链的连接顺序 与连接位置。,（六）苷键构型及氧环的确定 1、苷键构型测定方法如下： .分子旋光差法（klyne法） . 酶催化水解方法 例如：麦芽糖酶只能水解-苷键；苦杏仁酶只能水解-苷键等。, 1H-NMR判断糖苷键的相对构型通过C1-H与C2-H的偶合常数来判断苷键的构型. 例如：D-吡喃糖，-苷键 ：JH1-H2= 2-4Hz-苷键 ：JH1-H2 = 6-8Hz

4、, 13C-NMR判断糖苷键的构型通过C1-H1偶合常数来判断苷键的构型. 例如：D-葡萄吡喃甲苷，-苷键 ：JC1-H1= 170Hz-苷键 ： JC1-H1= 160Hz,3、糖氧环大小的测定 根据13CNMR数据来判断例如：吡喃糖环中13C3-NMR信号在72-78ppm;呋喃糖环中13C3-NMR信号在80ppm以上。 分析Smith降解产物也可判断氧环的大小。 利用甲醇解反应来判断呋喃型糖甲苷与吡喃型糖甲苷色谱行为不同。,二、糖链结构研究实例 皂角苷A的结构测定 1、皂角苷A为无定形粉末，是九糖三萜皂苷。 2、HR-FAB-MS负离子源测得分子量为： 1831.7649 M-H- 3

5、、结合13CNMR、DEPT谱确定皂角苷A分子式为：C82H128O45,4、有关1HNMR数据： 4.89(1H,d,J=7.3Hz), 4.99(2H,d,J=7.6Hz), 5.13(2H,d,J=7.1Hz), 5.32(1H,d,J=7.7Hz), 5.55(1H,d,J=7.3Hz), 5.93(1H,d,J=8.2Hz), 6.29(1H,s).,5、有关13CNMR数据： 94.4, 100.9, 103.8, 104.2, 104.9, 105.5, 105.8, 106.2, 106.9. 在100ppm处有9个吸收峰，说明 皂角苷A分子结构中含9个单糖。,6、碱水解结果：

6、获得一个三糖苷（次级苷） 说明皂角苷A分子结构中通过酯苷键连有一个六糖结构。7、酸水解后，再经过气相色谱分析，结果如下： 皂角苷A中所含单糖为夫糖、半乳糖、木糖、鸡纳糖与鼠李糖； 各单糖相互间的分子比为1：1：4：1：1,8、薄层酸水解后，与标准品对照证明皂角苷A中尚含有另一个单糖葡萄糖醛酸。 9、将酸水解后所得苷元再经过各种波谱数据对照证明，确认该苷元为皂树皂苷元。 10、ESI-MS谱图数据 m/z1699(M-H-132)提示：木糖(M=150，150-16-2=132)为末端糖；, m/z=955峰提示：脱掉了是一个六碳糖，在C3或C16位上连接的是一个由葡萄糖醛酸、 半乳糖及木糖组成

7、的三糖。 11、对所有13CNMR、1HNMR信号进行归属（很复杂！）归属的依据：1HNMR、13CNMR及其1H-1H COSY,1H-13C COSY 、NOESY等。,从表2-4可看到： A、有两个木糖E、F的端基质子化学位移值 完全一样，表示这两个氢信号重叠在一起。 B、有一个木糖H与鸡纳糖的端基质子化学 位移值完全一样，表示这两个氢信号也重叠 在一起。,12、通过HMBC（异核多键相关）谱确定糖与糖的连接关系 13、根据1JC1-H1、C1-H与C2-H偶合常数以及C1的化学位移值确定苷键的构型。,端基碳化学位移值下降,-2,-4,-7, 在被苷化的糖分子结构中，通常与端基碳直接相连

8、的-C的化学位移变化较大些，-C稍受影响，其他碳原子受到的影响则较少。 在确定了苷中糖的种类以后，将苷的13C谱 数据与相应单糖的13C谱数据进行比较，利用 苷化位移规律可确定苷中糖的连接位置。,例如：判断双糖苷中两单糖的连接位置 将双糖苷的13C谱数据与相应单糖的13C谱 数据进行比较； 如果内侧糖的某个碳原子的化学位移向低场方向移动了（通常是47ppm), 而与其相邻的两个碳原子之化学位移值又略向高场方向移动（约12ppm), 则内侧糖的这个碳原子就是糖的连接位置。,三、红外光谱IR,1.37003100cm-1间有明显O-H吸收峰。 2.如糖分子中含羧基、酰基等，则相应官能团 的IR吸收

9、峰可见。 3.多糖在1500960cm-1有许多吸收峰，其中 970730cm-1间的峰可用作端基碳构型判断。例如：840cm-1吸收峰 -L-吡喃糖苷890cm-1吸收峰 -D-吡喃糖苷,四、质谱,1、糖类难挥发，且热不稳定，需要制成挥发 性的衍生物才能进行质谱分析。 2、糖的立体异构体往往出现几乎相同的质谱， 仅在碎片丰度上稍有区别（不能用质谱来区别 糖的构型！）。 3、糖和苷的分子量：可用CI(化学电离), FD-MS 、FAB-MS等方法获得分子离子峰后测出。,4、软电离方式得到的碎片峰很少，但有可能获得从分子离子峰按顺序失去一个个糖基后的碎片离子峰。如果事先测定了多糖的组成，则可根据

10、质谱的碎片离子峰信息来推断原糖链的连接顺序。,第六节 糖链的结构测定, 主要解决四个问题 单糖的组成； 糖的氧环大小； 糖与糖之间的连接位置和顺序； 苷键构型。,（一）纯度测定方法 1、高压电泳法 原理：由于中性多糖导电性差、分子量大、 在电场中的移动速度慢，常将其制成硼酸络合 物进行高压电泳。 电泳支持体：玻璃纤维丝、纯丝绸布等。 缓冲液：pH=9-12的硼砂溶液。 电压：30-50V/cm, 时间： 30-120min 显色剂：p-甲氧基苯胺-硫酸。 注意：必须使用冷却系统，将温度维持在0,以免烧坏支持体。 本法常用 2、超离心法 原理：由于微粒在离心力场中移动的速度与微粒的密度、大小与形

11、状有关，故将多糖,溶液进行密度梯度超离心时，如果是组成均一 的多糖，则应呈现单峰。 具体做法：将多糖样品制成1%-5%的氯化钠或tris-盐 溶液，接着进行密度梯度超离心，待转速达到 恒定后（6000转/min），采用间隔照明法 检测其是否为单峰。,3、旋光光度法在多糖水溶液中加入乙醇使其浓度达到10% 左右，离心得沉淀。上清液再用乙醇使其浓度 达到20%-25%左右，离心得到第二次沉淀。 比较两次沉淀的比旋光度，如果比旋光度相同 则为纯品，否则为混合物。 4、其他方法如凝胶柱色谱、官能团摩尔比恒定法等。,（二）分子量测定 1、测定多糖分子量物理方法：沉降法、光散射法、黏度法和渗透压法等。 2

12、、凝胶过滤法简介：在凝胶柱上不同分子量的多糖与洗脱体积 成一定的关系。采用一系列结构相似的已知分 子量的多糖做标准曲线，进而测定样品多糖的 分子量。 该法用量小、操作较简便。,3、单糖、低聚糖及其苷分子量的测定 最常用FD-MS、FAB-MS与电喷雾-MS 4、多糖分子量的测定方法 基质辅助激光解析电离质谱（MALDI-MS） 基质辅助激光解析飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS).,（三）单糖的鉴定 1纸层析 展开系统：常用水饱和的有机溶剂 如：正丁醇：醋酸：水（4：1：5上层）BAW正丁醇：乙醇：水（4：1：2.2）BEW 展开方式：上行、下行等 显色剂：可利用糖的还原性或形成糠醛后 引

13、起的一些呈色反应。例如，, 邻苯二甲酸苯胺 硝酸银试剂（使还原糖显棕黑色） 三苯四氮唑盐试剂 （单糖和还原性低聚糖呈红色） 3,5-二羟基甲苯-盐酸试剂（酮糖呈红色） 过碘酸-联苯胺（糖、苷和多元醇中有邻二-OH结构显兰底白斑）。,2薄层层析 采用（硼酸液/无机盐）+ 硅胶 制板 吸附剂：硅胶 显色剂：除纸层析应用以外，还有H2SO4/H2O或 乙醇液、茴香醛-硫酸试剂、 苯胺-二苯胺磷 酸试剂等。,3气相层析 将糖制备成三甲基硅醚 醛糖用NaBH4还原成多元醇，制成乙酰化物或三氟乙酰化物。 4离子交换层析 原理：糖的硼酸络合物可进行离子交换层析, 优点：不必制成衍生物，而直接用水溶液进行分离

14、（与气相比较） 需要仪器糖自动分析仪 5液相色谱 填充材料化学修饰的硅胶 优点：不必制备成衍生物。适合分析对热不稳定的、不挥发的低聚糖和多糖。 缺点：灵敏度不及气相层析高。, 多糖组成的鉴定 1、必要性：低聚糖、多糖的结构分析，首先要了解由哪些单糖所组成、各种单糖之间的比例等。 2、多糖组成鉴定过程：将苷键全水解，用PC检出单糖的种类，经显色后用薄层扫描仪求得各种糖的分子比（也可用GC或HPLC对各单糖定性定量分析）。,（四）糖连接位置的测定 1、化学方法：多采用甲基化法 过程：将糖链全甲基化，然后水解所有的苷键，用气相色谱法对水解产物甲基化单糖进行定性和定量分析。 甲基化过程：常用箱守法(H

15、akomori) 水解过程：通常先用90%甲酸全水解，然后用0.05mol/L H2SO4或三氟乙酸水解。, 气相色谱法定性和定量分析：选择各种单糖的标准品，分别与水解后得到的各种甲基化单糖进行比较，具有游离-OH的部位就是糖的连接位置，而全甲基化的单糖即为末端糖。 计算过程：算出所得各甲基化产物相互之间的比例，据此可推测出糖链重复单位中各种单糖的数目。,全甲基化 水解,游离羟基,游离羟基,2、NMR谱法（了解内容） 13CNMR谱法：目前用来确定糖的连接位置的常用方法 该法是在归属各碳信号的基础上，以游离苷元和甲基糖苷作为参考化合物，确定产生苷化位移的碳，然后利用苷化位移规则，即可方便地获知各单糖的连接位置。, 1HNMR谱法： 先使糖与苷乙酰化，再比较不同类型质子的化学位移。例如：CHOAc中CH质子的化学位移为4.755.4ppm; 而CH2OAc、CH2OR中质子在3.04.3ppm；端基质子介于这两者之间。 通过2D-NMR判定质子的归属，从而得出糖的连接位点。,