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1、好氧发酵产物积累机制,好氧性发酵(aerobic fermentation)：在发酵过程中需要不断地通入一定量的无菌空气，如利用黑曲霉进行柠檬酸的发酵、利用棒状杆菌进行谷氨酸的发酵、利用黄单孢菌进黄原胶多糖的发酵等等糖的分解代谢包括糖酵解（糖的共同分解途径）和三羧酸环（糖的最后氧化途径）。,在有氧条件条件下：丙酮酸进入线粒体，脱氢和脱羧生成乙酰COA，在TCA循环中脱氢，并氧化形成CO2和 H2O，或者各种代谢物，NADH2经呼吸链将氢传递给氧生成水。另外，乙酰辅酶A在生物合成过程中作为C2化合物加以利用，形成脂肪等。,第一节 柠檬酸的发酵机制 一、柠檬酸的合成途径黑曲霉 (Asp.niger
2、) 原料：sugar ， alcohol， acetic acid途径： EMP（HMP）丙酮酸羧化TCA环 黑曲霉生长，EMP与HMP途径的比率是2：1，生产柠檬酸时为4：1。葡萄糖 柠檬酸(citric acid)理论转化率106.7%,R,TCA循环,柠檬酸的生物合成途径,1,2,二、 柠檬酸生物合成的代谢调节,积累柠檬酸应采取的措施：想方设法提高柠檬酸合成反应所需酶的活力；必须切断柠檬酸的去路；顺乌头酸酶失活，环阻断。保证中间产物的供给；草酰乙酸的及时供给， 丙酮酸 二氧化碳固定反应对柠檬酸 积累有重要意义。CO2 乙酰COA 草酰乙酸,1 糖酵解及丙酮酸代谢的调节,第一个调节的酶是磷
3、酸果糖激酶（PFK）：AMP、无机磷、NH4+对该酶有活化作用 ATP、柠檬酸对该酶有抑制作用Q：PFK在正常生理条件下能被柠檬酸抑制，但在柠檬酸发酵中，柠檬酸浓度很高，为什么EMP途径仍能保持畅通呢？,由于TCA循环降低，ATP的生成减少，蛋白质和核酸合成受阻，细胞内的NH4+异常高，从而降低了柠檬酸对PFK的抑制。 柠檬酸发酵需要下述环境条件：磷酸盐浓度低；氮源为NH4+盐； pH值低（低于2.0）； 溶氧量高；Mn2+ 、 Fe2+ 、 Zn2+含量极低。柠檬酸发酵中黑曲霉对Mn2+极端敏感。黑曲霉在缺锰的条件下发酵 ，细胞有生理和代谢的变化。Mn2+的效应可以认为是NH4+水平升高而减
4、弱了柠檬酸对EMP途径关键酶（PFK）的抑制。,第二个调节的酶是丙酮酸激酶（PK） PK 被NH4+ 、K+激活 磷酸烯醇丙酮酸丙酮酸ATP 二氧化碳的固定反应参与二氧化碳固定反应的酶： 丙酮酸羧化酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶,2 TCA环的调节,柠檬酸合成酶是该途径的第一个限速酶，由乙酰辅酶中的高能硫酯键水解释放大量能量，推动合成柠檬酸。柠檬酸 顺乌头酸 异柠檬酸两步反应均由顺乌头酸酶催化，该酶需要Fe+， I 若用络合剂除去反应液中的铁，则酶活性被抑制，造成柠檬酸的积累。,II 阻断顺乌头酸酶的催化作用：该酶是个含铁的非血红蛋白，以Fe4S4作为辅基。因此，在菌体生长到足够菌数时，适量加入亚
5、铁氰化钾（黄血盐），使与铁硫中心的Fe+ 生成络合物，则该酶失活或活性减少，而积累柠檬酸。 III 通过诱变或其他方法，造成生产菌种顺乌头酸酶的缺损或活力很低，同样积累柠檬酸。3 及时补加草酰乙酸外加草酰乙酸 选育回补途径旺盛的菌种。,柠檬酸积累机理,1、由于锰的缺乏，抑制了蛋白质的合成，而导致细胞内的NH4+ 浓度升高，促进了EMP途径的畅通。2、由组成型的丙酮酸羧化酶源源不断提供草酰乙酸。3、在控制Fe+含量的情况下，顺乌头酸酶活性低，从而使柠檬酸积累。顺乌头酸水合酶在催化时建立如下平衡 柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸90 ：3：7,4、丙酮酸氧化脱羧生成乙酰辅酶和丙酮酸固定CO反应相平衡，以
6、及柠檬酸合成酶不被抑制，增强了合成柠檬酸的能力。5、柠檬酸积累增加，pH降低，在低pH条件下，顺乌头酸水合酶和异柠檬酸脱氢酶失活，从而进一步促进了柠檬酸自身的积累。,第二节醋酸发酵机制淀粉 糖 酒精 醋酸1. 醋杆菌发酵酒精成醋酸乙醇向醋酸转化是分两步进行的，中间产物是乙醛。CH3CH2 OH E1 CH3CHO E2 CH3COOHE1 乙醇脱氢酶 或乙醇氧化酶，它依赖于NAD。E2 乙醛脱氢酶 ，需要NADP作辅酶。醋杆菌为G-，好氧菌，1mol乙醇转化为1mol醋酸，理论转化率是130。,2 热醋酸梭菌生产醋酸热醋酸梭菌在发酵糖类时，由糖到醋酸一步完成，还可以将CO2还原为醋酸。 CO2
7、是通过甲酰四氢叶酸（THF）和类咕啉蛋白形成醋酸的。但该菌没有氢化酶活性，不能利用氢气。C6H12O6 +2H2O 2CH3COOH+2CO2+8H+8e2CO2+8H+8e CH3COOH+ 2H2O净反应 C6H12O6 3CH3COOH反应在厌氧条件下进行的，由己糖或戊糖生成醋酸的理论产率都是100。热醋酸梭菌为产芽孢菌，周生鞭毛，耐高温，最适生长温度5560C，转化率高，严格厌氧，还可以利用戊糖。但这种方法发酵时需中和剂，因此只适合于醋酸盐。,第三节 谷氨酸发酵机制,氨基酸发酵工业是利用微生物的生长和代谢活动生产各种氨基酸的现代工业。氨基酸发酵是典型的代谢控制发酵。由发酵所生成的产物氨
8、基酸，都是微生物的中间代谢产物，它的积累是建立于对微生物正常代谢的抑制。也就是说，氨基酸发酵的关键是取决于其控制机制是否能够被解除，是否能打破微生物的正常代谢调节，人为地控制微生物的代谢。,一.谷氨酸生物合成途径谷氨酸的生物合成途径有EMP途径、HMP途径、 TCA循环、乙醛酸循环和CO2固定反应。葡萄糖先生成谷氨酸，依次经鸟氨酸，谷氨酸生物合成精氨酸。谷氨酸的生物合成途径如图所示。,二.谷氨酸生物合成的调节机制,三. 谷氨酸发酵的代谢控制谷氨酸发酵的代谢控制一般采取下列措施。1控制发酵的环境条件氨基酸发酵受菌种的生理特征和环境条件的影响，对专性好氧菌来说，环境条件的影响更大。谷氨酸发酵必须严
9、格控制菌体生长的环境条件，否则就几乎不积累谷氨酸。下表表示谷氨酸生产菌因环境条件改变而引起的发酵转换，这也就是说氨基酸发酵是人为地控制环境条件而使发酵发生转换的一个典型例子。,2控制细胞膜渗透性在发酵过程中，控制使用那些影响细胞膜通透性的物质，有利于代谢产物分泌出来，从而避免了末端产物的反馈调节，有利于提高发酵产量。以葡萄糖为原料，利用谷氨酸棒状杆菌发酵生产谷氨酸时，谷氨酸生产菌为-酮戊二酸脱氢酶缺失突变株，当谷氨酸的合成达到50 mg/g（干细胞）时，由于反馈调节作用，谷氨酸的合成便终止。如果改变细胞膜通透性，使胞内代谢产物谷氨酸渗透到胞外，有利于提高发酵产量。,所以代谢产物的细胞渗透性是氨
10、甚酸发酵必须考虑的重要因素。对于谷氨酸发酵来说，生物素是谷氨酸发酵的关键物质。当细胞内的生物素水平高时，谷氨酸不能透过细胞膜，因而得不到谷氨酸。谷氨酸发酵生产中，谷氨酸生产菌菌属于生物素缺陷型菌种，生物素作为脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰CoA羧化酶的辅酶，参与了脂肪酸的合成，进而影响磷脂的合成。当磷脂合成减少到正常量的一半左右时，细胞变形，谷氨酸向膜外漏出，积累于发酵液中。,因而可以通过限量控制生物素的含量，也就是通过控制生物素亚适量，提高细胞膜的渗透性。在发酵的前期，满足细胞的生长，合成完整的细胞膜；中期生物素耗尽，细胞膜合成不完整，完成长菌型细胞向产酸型细胞的转变，细胞膜的渗透性增加
11、，使得谷氨酸渗透到细胞外，在细胞内谷氨酸达不到引起反馈调节的程度，从而使谷氨酸能够源源不断被优先合成。,影响谷氨酸产生菌细胞膜通透性的物质可分为两大类：一类是生物素、油酸和表面活性剂，其作用是引起细胞膜的脂肪酸成分或量的改变，尤其是改变油酸含量，从而改变细胞膜通透性；另一类是青霉素，其作用是抑制细胞壁肽聚糖合成中肽链的交联，由于细胞膜失去细胞壁的保护，细胞膜受到物理损伤，从而使渗透性增强。另外，代谢控制还包括控制支路代谢，消除终产物的反馈抑制和反馈阻遏等等。,三、现有谷氨酸生产菌的主要特征从细菌的鉴定和分类的结果来看，现有谷氨酸生产菌分属于捧状杆菌属、短杆菌属、小杆菌属及节杆菌属，但是它们在形
12、态及生理方面仍有许多共同的特征。归纳起来主要有以下特征。 （1）细胞形态为球形，棒形以至短杆形。 （2）革兰氏染色阳性，无芽孢，无鞭毛，不能运动。（3）都是需氧型微生物。（4）都是生物素缺陷型。（5）脲酶强阳性。（6）不分解淀粉、纤维素、油脂、酪蛋白及明胶等。（7）发酵中菌体发生明显的形态变化，同时发生细胞膜渗透性的变化。,（8）CO2固定反应酶系活力强。 （9）异柠檬酸裂解酶活力欠缺或微弱，乙醛酸循坏弱。 （10）-酮戊二酸氧化能力缺失或微弱。 （11）还原型辅酶（NADPH2）进入呼吸链能力弱。（12）柠檬酸合成酶、乌头酸梅、异柠檬酸脱氢酶以及谷氨酸脱氢酶活力强。（13）能利用醋酸，不能利
13、用石蜡。 （14）具有向环境中泄漏谷氨酸的能力。（15）不分解利用谷氨酸，并能耐高浓度的谷氨酸，产谷氨酸5%以上。,第五节 抗生素发酵机制 次级代谢产物-(secondary metabolite),分解代谢：将从环境中吸收的各种碳源、氮源等物质降解，为细胞的生命活动提供能源和小分子中间体。如TCA、EMP和HMP等。 合成代谢：利用分解代谢的能量和中间体合成氨基酸、核酸等单体物质，及蛋白质、核酸、多糖等多聚物。,代谢类型,初级代谢和次级代谢初级代谢：与生物生存有关的，涉及能量产生和能量消耗的代谢类型。产物都是有机体生存必不可少的物质，如单糖、核苷酸、脂肪酸，以及蛋白质、核酸、多糖、脂类等。
14、次级代谢：某些微生物为了避免代谢过程中，某种代谢产物的积累造成的不利作用，而产生的一类有利于生存的代谢类型，通常是在生长后期产生。产物种类很多，最著名的是抗生素，其它还有氨基糖、香豆素、麦角生物碱、吲哚衍生物、核苷、肽、喹啉等。,一、 次级代谢产物的特征,、次级代谢产物是由微生物产生，不参与微生物的生长与繁殖。、次级代谢产物的生物合成最少也要有一部分取决于与初级代谢产物无关的遗传物质，并与由这类遗传信息形成的酶所催化的代谢途径有关。、它的生产大多数是基于菌种的特异性来完成的。、次级代谢产物发酵经历两个阶段，即营养增殖期和产物形成期。如在菌体活跃增殖阶段几乎不产生抗生素。待到细胞停止生长，进入到
15、恒定期才开始活跃地合成抗生素，成为生产期。,、一般都同时产生结构上相类似的多中副组分。、生产能力受微量金属离子（Fe2+、 Fe3+、Mn2+、Co2+、Zn2+）和 磷酸盐等无机离子的影响。、 在多数条件下，增加前体是有效的。、 次级代谢酶的底物特异性在某种程度上说是比较广的。若提供底物结构类似物，则可得到与天然物不同的次级代谢物。、培养温度过高或菌种移植次数过多，使抗生素生产能力下降，可能的原因是参与抗生素合成的菌种的质粒脱落。、一种产物可由多种中间体和途径来取得。,二、生物合成抗生素与初级代谢的关系1.从代谢方面分析：许多抗生素的基本结构是由少数几种初级代谢产物构成的，所以次级产物是以初级产物为母体衍生出来的，次级代谢途径并不是独立的，而是与初级代谢途径有密切联系的。糖代谢的中间体，即可以来合成初级代谢产物，又可以来合成次级代谢产物，这种中间体叫分叉中间体，如丙二酰Co。G 乙酰 Co 丙二酰 CoA 脂肪酸（初级）四环素或其他抗生素（次级）,
