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1、第四章 细胞碎片与包含体产品的分离,主要讲授内容,4.1 细胞碎片的分离 4.2 包含体的分离与与蛋白质的复性,生物分离过程的一般流程,4.1 细胞碎片的分离,细胞破碎悬浮液中的固体颗粒包括：细胞壁碎片、膜碎片、细胞器、包含体、完整细胞等。 颗粒尺寸范围：0.110m，大多0.21.0 m。 粘度：为细胞悬浮液的210倍。 固-液分离难度比发酵液困难得多!,4.1.1 离心沉降,离心机的基本要求：分离因素( )大于5000常用离心机：管式离心机最大分离因素可达50000以上碟片式离心机最大分离因素可达15000以上,式中： r-旋转半径（m）-离心机的旋转角转速（1/s）g-重力加速度f 离心
2、力 分离效果,=2n n-离心机的转速 (1/s),离心沉降的特点：,（1）可通过控制进料流量来达到所要求的分离目的。如：碟片式离心机的最大允许流量为：式中：d 颗粒直径（m）S 固体颗粒密度（kg/m3）L 液体密度（kg/m3） 液体粘度（kg/m.S）g 重力加速度（m/S2）离心机的角转速（1/S）Z 离心机的特征常数 （2）投资高，能耗大。,由此公式可根据所要求分离的最小颗粒尺寸计算离心机的流量： 由于 Q d2 要分离的 最小颗粒料尺寸 允许的最大流量,由此公式可根据所要求分离的最小颗粒尺寸计算离心机的流量： 由于 Q d2 要分离的最小颗粒料尺寸 允许的最大流量,4.1.2 微过
3、滤（MF）,MF孔径： 0.0110m 可截留颗粒直径： 0.0210m 特点：（1）设备投资少，能耗低，不受液固密度差的影响。（2）分离效果影响因素较多，存在膜的泄漏与堵塞问题。,4.1.3 双水相萃取,一般萃取系统：有机相和水相 双水相萃取系统：轻相富含某种高分子化合物的水溶液重相富含盐类或另一种高分子化合物的水溶液 80年代开始用来分离生物大分子、细胞碎片和细胞蛋白质 可克服离心分离中投资高、能耗大的缺点，也不存在MF中膜的泄漏和堵塞问题。,如聚乙二醇（PEG）/葡聚糖（Dx）,聚丙二醇/聚乙二醇，甲基纤维素/葡聚糖。双水相萃取中采用的双聚合物系统是PEG/Dx，该双水相的上相富含PEG
4、，下相富含Dx。另外，聚合物与无机盐的混合溶液也可以形成双水相，例如，PEG/磷酸钾（KPi）、PEG/磷酸铵、PEG/硫酸钠等常用于双水相萃取。PEG/无机盐系统的上相富含PEG,下相富含无机盐。,某些亲水性高分子聚合物的水溶液超过一定浓度后可以形成两相，并且在两相中水分均占很大比例，即形成双水相系统（aqueous two-phase system,ATPS）。利用亲水性高分子聚合物的水溶液可形成双水相的性质，Albertsson于20世纪50年代后期开发了双水相萃取法（aqueous two-phase extraction），又称双水相分配法。20世纪70年代,科学家又发展了双水相萃取
5、在生物分离过程中的应用，为蛋白质特别是胞内蛋白质的分离和纯化开辟了新的途径。,4.1.4 泡沫分离法,一种基于悬浮液中的颗粒（或溶质）间表面活性的差异而进行分离的一种方法。表面活性强的物质优先吸附于气相与液相的界面处（即气泡表面），被气泡带出而达到浓缩。 在生物领域，主要用于分离（收集或除去）细胞、细胞碎片、蛋白质和酶。 相对于离心与膜分离而言，泡沫分离更适合于低密度和低浓度悬浮物的分离与去除。 注意：蛋白质容易在气、液界面失活。,4.1.5 吸附分离,吸附分离的方式： （1）向细胞碎片悬浮液中加入固体吸附剂。 （2）流化床/固定床用细胞碎片悬浮液通过装有吸附剂的流化床或固定床。,（3）扩张床
6、床层中介质（吸附剂）处于松散状态，床层可上下浮动。综合了固定床和流化床的优点，克服了流化床的返混问题和固定床颗粒间隙的堵塞问题。,（4）膜吸附将微孔膜进行处理，使之带有离子交换、亲和配基等吸附基团。 这样液体中的溶解产物分子也可被膜吸附，加入适当的洗脱剂后即可分离出目的产物。于是，一步膜分离的效果相当于过滤、浓缩和吸附三步操作。,4.1.5 吸附分离,吸附分离的特点：（1）有可能回收液体中的全部产物。（2）操作时间短，减少了产物受污染和降解的机会。（3）在吸附的同时可除去大量液相杂质。（4）设备简单，能耗低。（5）合适的吸附剂较难选择，特别是当目的产物在液相时，要注意目的产物被吸附而损失。,4
7、.2 包涵体的分离与蛋白质的复性,什么是包涵体 外源蛋白质在大肠杆菌中高效表达时常形成不可溶、无生物活性的聚集体(aggregation)又称包涵体(inclusion body)。 以包涵体形式存在的聚集蛋白质分子不具有正确的三维结构(天然结构),它们在水溶液中通常不溶解且没有活性,包含体必须经过变性、复性才能获得生物学功能。,包含体（Inclusion bodies）一种不具生物活性的蛋白产物。多为克隆表达产物，这些产物在一级结构上是完全正确的，但在高级结构上是错误的，因而不具生物活性。 包含体形成机理外源蛋白质在合成过程中缺乏某些协助因子或周围环境不适，使其次级键（氢键等）的形成受影响，
8、最终形成不具活性的包含体产品。,包含体的特性：(1)颗粒直径0.51.0m，可在相差显微镜下观察到。(2)外围全部被疏水基团包围，不溶于一般水溶液。(3)质体坚硬，比重较大，适于离心分离，如采用高压匀浆则易造成匀浆阀的破坏。 包含体产品的提取与分离较复杂，回收率一般不超过20%。,包涵体的形成,图3.8 蛋白质的合成、折叠与聚集示意图,包涵体形成的原因主要是高水平表达的结果。活性蛋白的产率取决于蛋白合成的速率、蛋白折叠的速率、蛋白聚集的速率(如图3.8所示)。在高水平表达时,新生肽链的聚集速率一旦超过蛋白正确折叠的速率就会导致包涵体的形成。,重组蛋白分子内及分子间二硫键的错配 由于重组蛋白在大
9、肠杆菌中表达时,缺乏一些蛋白折叠过程中需要的酶和辅助因子,如折叠酶和分子伴侣等,是包涵体形成的又一原因。,包涵体形成对重组蛋白的生产的优势:,包涵体具有高密度,易于分离纯化； 重组蛋白以包涵体的形式存在有效地抵御了大肠杆菌中的蛋白酶对目的蛋白的降解； 对于生产那些处于天然构象时对宿主细胞有毒害的蛋白时,包涵体形成无疑是最佳选择。,包涵体的纯化方法,包含体的出现不仅增加了生物分离设计的难度，也为蛋白质折叠机理研究提出了新的课题。 欲获得天然活性态的目标产物，必需分离包含体后，溶解包含体并使其中的目标蛋白恢复应有的天然活性。,收集菌体细胞,细胞破碎,包涵体的洗涤,目标蛋白的变性溶解,目标蛋白的复性
10、,包涵体获得 几种常见的工艺路线(一),机械破碎 (高压匀浆、高速珠磨）,离心提取包含体,加变性剂溶解,除变性剂复性,路线1 的特点,特点:是利用了包含体与细胞碎片的密度差，用离心法将包含体与细胞碎片和可溶性蛋白质分开，获得了干净的包含体，再对包含体溶解复性。 优点：摆脱了大量的杂蛋白、核酸、热原、内毒素等杂质，使后面的分离纯化简单了。从这个角度上讲，包含体的形成对分离纯化亦有好处。 缺点:要经过几次离心才能除去大部分的细胞碎片，加工时间较长。,包涵体获得 几种常见的工艺路线（二）,机械破碎,膜分离获得包涵体,加变性剂溶解包含体,除变性剂复性,路线2 的特点,路线2应用了膜分离技术，用微孔膜除
11、去可溶性蛋白质。 优点是封闭式操作，不污染环境也不受环境污染，能量消耗也比离心法少。 缺点：细胞碎片和包含体一起被膜挡住，难以分开；而且膜的堵塞和浓差极化常常导致可溶性蛋白质的滞留。,包涵体获得 几种常见的工艺路线（三）,化学破碎 （加变性剂）,离心除细胞碎片,除变性剂复性,路线3的特点,用化学法破碎，所采用的试剂既可以破碎又可以溶解包含体，将两道工序和为一道，节省了设备和时间，比前两者更适合于实验室操作。 缺点是所有的可溶性杂质都没有除去，混杂在产物中间，给后续分离带来困难。,蛋白质的复性,不溶性包含体：离心,收集菌体细胞破碎离心,收集沉淀包含体洗涤目标蛋白变性溶解复性纯化。 inclusi
12、on bodies IBs,复性步骤: 用脲或盐酸胍等变性剂溶解包涵体使其变成伸展的肽链结构。 脱除变性剂，使伸展的肽链折叠成正确的空间结构。,1）包涵体的洗涤,细胞破碎后，包含体呈颗粒状，致密。 洗涤的重要性：收集的沉淀中，除包涵体外，还包括许多杂质，如膜蛋白、肽聚糖、脂多糖等，复性时会与目标蛋白一起复性形成杂交分子而聚集，给后步纯化带来困难。 洗涤剂：温和的表面活性剂、蔗糖、低浓度的弱变性剂（如尿素）或脱氧胆酸等。能溶解除去部分膜蛋白和脂质类杂质。 洗涤剂浓度:以溶解杂质，不溶解包涵体中表达产物为原则。,2）目标蛋白的变性溶解,包涵体中不溶性的目标蛋白必须溶解到液相中，才能进一步纯化。一般
13、水溶液很难将其溶解，只有采用蛋白质变性才能使其形成可溶性的形式。,常用变性剂：5-8 mol/L盐酸胍和6-8 mol/L尿素, 作用：破坏离子间相互作用； 表面活性剂如1-2 SDS，作用：破坏蛋白质肽链间的疏水相互作用。 pH9.0的碱溶液和有机溶剂，使用较少。影响变性因素：时间、pH、离子强度、变性剂种类和浓度。,3） 目标蛋白的复性,原理：在变性剂溶液中，溶解的蛋白质呈变性状态，即蛋白质高级结构被破坏，但一级结构和共价键没有破坏。当部分变性剂被除去后，蛋白质会重新折叠成具有活性的正确构型，该过程称复性。,复性方法： 稀释法除变性剂 加入大量水或缓冲液。 膜分离法除变性剂 透析、超滤、电
14、渗析。 层析法：凝胶层析，高效疏水层析,蛋白质复性影响因素：,变性剂浓度 目标蛋白浓度； pH和离子强度； 氧化还原条件。 还原剂： 二硫苏糖醇、-巯基乙醇、 还原型谷胱甘肽； 氧化剂： 氧化型谷胱甘肽; 碱性下通空气。,盐酸胍浓度mol/L,红血球碳酐酶复性操作中变性剂 与蛋白质浓度对复性的影响,蛋白质浓度 mol/L,提高复性成功率采取措施： 在低浓度下进行蛋白质复性（稀释 复性) 膜分离法脱除变性剂 加入凝集抑制剂 加入分子伴侣 层析复性（吸附和凝胶过滤色谱） 反胶团萃取 双水相萃取,（1）稀释法,将溶液稀释，降低变性剂浓度，使蛋白质复性： 水或缓冲溶液（蛋白质生理pH，50倍） 变性溶
15、液(6mol/L)稀释液(0.12 mol/L) 部分蛋白质复性,稀释复性 1050g/ml 缺点：降低蛋白质浓度势必增大蛋白质溶液体积,给后续的分离纯化增加困难，耗费大 解决办法：将流加操作引入复性过程,即以流加的方式向复性缓冲液中输入变性蛋白质。由于在流加的同时复性液中的蛋白质发生折叠复性,使变性蛋白质浓度始终保持在较低的水平,可在较高的蛋白质终浓度下获得高复性收率。这种复性方法在变性溶菌酶复性中得到了验证。,2、膜分离法脱除变性剂,膜分离法中可采用透析、超滤或电渗析等除去变性剂。此法不会增加料液体积和降低目标蛋白浓度，克服了稀释法的缺点 。 缺点：透析法耗费时间较长，易形成蛋白质沉淀。超
16、滤和电渗析速度较快，由于剪切力，容易使蛋白失活，且易引起膜污染，操作时应注意。,3、加入凝集抑制剂,由于分子间疏水性作用导致的聚集体生成是影响蛋白质复性收率的主要原因,加入凝集抑制剂抑制聚集体的生成,从而开发了“添加稀释”复性技术。甘油、聚乙二醇、表面活性剂、单克隆抗体和丙酮；另添加肽基 脯氨酰基顺反异构酶、 精氨酸和谷胱苷肽等促使蛋白质某些结构位点(如二硫键)的形成,也可促进蛋白质折叠复性。 缺点：体系中增加新物质，增加后续纯化难度。,4、加入分子伴侣,分子伴侣(一种蛋白质,如：GroEL和GroES)在体内和体外均可辅助蛋白质折叠成正确的天然态。 GroEL分子可通过疏水性作用捕获变性蛋白质,诱导蛋白质的折叠。同时,在GroES和腺苷三磷酸(ATP)的共同作用下,部分或完全折叠的蛋白质被释放到溶液中,未完成折叠的蛋白质可被GroEL重新捕获,直至复性完全为止。,
