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1、1密闭舱室内非金属材料燃烧释放有毒气体对大鼠肺组织密闭舱室内非金属材料燃烧释放有毒气体对大鼠肺组织 SP-ASP-A的影响的影响安辉 孙磊 周燕虹 曹佳1摘要：目的摘要：目的 观察密闭舱室内非金属材料燃烧释放有毒气体对大鼠肺毛细血管通透性及肺表面活性物质相关蛋白 A 的影响，为防护和治疗提供理论依据。方方法法 建立密闭舱内动物烟雾吸入模型，将 36 只 SD 大鼠随机分为对照组及烟雾吸入后 1h、6h、24h、72h 和 7d 组，观察吸入损伤后不同时相点肺组织的病理改变，肺水含量及肺通透指数的变化，采用 Real time PCR 法检测大鼠肺组织 SP-A mRNA 的表达。结果结果 烟雾
2、吸入后大鼠肺组织病理改变与急性肺损伤样的病理改变特征相似, 24h 为肺组织病理改变最严重期，在此期间动物的肺水含量也较对照组有明显增加(P 0.05)；肺泡灌洗液及血清中蛋白含量在烟雾吸入后不同时相点均增高，肺通透性指数在 1h、6h 和 24h 显著高于对照组(P0.05)；烟雾吸入后各时相点动物肺组织 SP-A mRNA 表达均降低，其中 1h、6h、24h 和 72h 组与对照组比较差异显著(P 0.01)。结论结论 密闭舱室内非金属材料燃烧释放的毒性气体可引起肺泡毛细血管通透性的改变，肺血管及间质之间液体交换障碍，导致肺水肿进而引发急性肺损伤样。关键词：关键词：烟雾吸入；肺损伤；肺通
3、透性；表面活性物质相关蛋白 A； Effect of poisonous gas produced from the combustion of nonmetal materials on the expression of SP-A AN Hui, SUN Lei, ZHOU Yan-hong, CAO Jia. (Department of Hygienic Toxicology, Preventive Medical College, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China)基金项目：全军医药卫生科研基金课题资
4、助项目（06z032） 作者简介：安辉，女，河北省石家庄市人，博士研究生，主要从事军事毒理学方面的研究。 电话：（023）68772388 通讯作者：曹佳，电话：（023）68752271，email: caojia ，2Abstract: Objective To investigate the effect of poisonous gas produced from the combustion of nonmetal materials on the Pulmonary microvascular permeability and the expression of SP-A, in
5、order to provide a theoretical basis for protective measure and treatment. Methods: The model of smoke inhalation injure in rat were set up, thirty-six rat were randomly divide into six groups such as control group, and the group of 1h、6h、24h、72h and 7d following smoke inhalation. The pathological c
6、hanges in lung tissue were observed, the lung water content and the index of pulmonary microvascular permeability were examined. The expression of SP-A mRNA in lung tissue were measured by Real time PCR. Results Histopathology observation post-exposure showed that a great similarity in the changes o
7、f the injury to acute lung injury. The histopathology changes of lung tissue were most severe at 24h post-exposure, and during this period lung water content increased significantly (p0.05). The protein content of BALF and serum increased obviously in the smoke exposure groups, the index of pulmonar
8、y permeability of 1h, 6h and 24h groups were obviously higher than that of the control group (p0.05); The expression of SP-A mRNA in lung tissue was significantly decreased in the smoke exposure groups, 1h, 6h, 24h and 72h groups had a significant difference with control (p0.01). Conclusion Pulmonar
9、y microvascular permeability and the expression of SP-A can be significantly influenced by the poisonous gas produced by nonmetal materials of cabin in combustion, which may induced the function of the liquid exchange between pulmonary vascular and interstitial disordered, pulmonary edema and acute
10、lung injury occurred. Key words: smoke inhalation; lung injury; pulmonary microvascular permeability; surfactant-associated protein A坦克和装甲车等军事工事舱室内部环境狭小，是个相对密闭的环境，受到导弹或炮弹袭击后，其舱室内非金属材料可因高温燃烧，在迅速消耗氧气的同时释放大量烟雾。因此当密闭舱室内发生火灾时将产生比普通建筑物火灾更严重的后果，释放的烟雾也是是阻碍作战人员逃生或死亡的主要原因之一。SP-A 为亲水性蛋白，约占特异性结合蛋白(surfactant-as
11、sociated protein，SP)的 50左右，在调节磷脂的分泌和摄取，维持表面活性物质结构和功能的完整性等方面具有重要作3用1。因此本研究以烟雾吸入性损伤大鼠为研究对象，观察烟雾吸入对肺毛细血管通透性及肺表面活性物质相关蛋白 A 的影响，探讨其损伤机制，为相关人员采取合理的防护与救治措施提供重要的理论依据。1 材料与方法1.1 主要试剂与仪器Bradford 蛋白浓度定量试剂盒为上海生工生物工程有限公司产品，Trizol 为美国 Invitrogen 公司产品，SP-A 及 -actin 引物、PrimeScriptTM RT reagent Kit、SYBR ExScriptTM R
12、T-PCR Kit 均为大连 TaKaRa 工程有限公司产品。Spectra Max M2/M2e 酶标仪为美国 Molecular device 公司产品，紫外凝胶成像仪为美国Gene company limited 公司产品，ND-100 紫外分光光度计为美国 Nanodrop 公司产品，7300Real-Time PCR System 为美国 Applied Biosystems 公司产品。燃烧材料为坦克舱室内使用的 9 种非金属材料，由相关军事单位提供。燃烧箱与实验箱为本室自行设计和研制，由两边的循环管道相连，按照舱室实际体积和大鼠体积等比缩小。1.2 动物模型与实验分组健康雄性 SD
13、 大鼠 36 只（第三军医大学第三附属医院动物中心提供） ，体重200g20g，随机分为 6 组，每组 6 只，即：正常对照组，吸入性损伤1h、6h、24h、72h 和 7d 组。将燃烧材料按一定的用量比剪成 1010mm 的小块置于燃烧箱内，用液化气炉点燃非金属材料发烟 3min 后，将实验动物放入染毒箱内吸入染毒 10min，然后将动物取出呼吸空气。1.3 肺组织病理改变取右肺上叶肺组织，迅速放入 4多聚甲醛溶液中固定 24h，然后进行石蜡包埋 HE 染色，光镜下观察肺组织病理学改变。1.4 肺水含量测定取右肺中叶，吸水纸吸干表面水分及血液，称重。然后置于 80烤箱 72 h后称量肺干重，
14、计算湿干重比(W/D)。1.5 肺通透指数的检测股动脉收集血液于 10ml 的无抗凝管中，2500rpm，4离心 10min，分离血浆检测蛋白含量。开胸取出肺脏，寻找气管分叉，分离气管，结扎右侧主支气管，4用冰生理盐水进行左肺肺泡灌洗，4ml3 次，回收率大于 85。将全部灌洗液收集, 测总容量。然后将肺泡灌洗液离心(1000rpm，4，10min)，留取上清采用Bradford 法测蛋白含量3。计算肺通透性指数 PPI = BALF 蛋白含量/血浆蛋白含量4。1.6 Real time PCR 检测肺组织 SP-A mRNA 的表达1.6.1 总 RNA 的提取将超低温冻存的右肺下叶部分组织
15、 (50-100mg)称重后迅速转移至用液氮预冷的研钵中，采用 Trizol 法提取总 RNA，用 ND-100 紫外分光光度计检测其浓度，并用 1DEPC 水调整浓度至 500ng/ul。1.6.2 cDNA 的合成按照 PrimeScriptTM RT reagent Kit 说明将总 RNA 逆转录为 cDNA。1.6.3 Real time PCR SP-A 上游引物：5- AGGAGCTCCAGACTGAACTCTATGA-3, 下游引物：5-CT GA CT GCCCATTGGTGGAA-3，产物长度 123bp;-actin 上游引物：5- GGAGATTAC TGCC CTG
16、GCTCCTA-3,下游引物：5- GACTCATCGTACTCCTG CTTGCTG -3，产物长度 150bp。反应体系 20ul，反应条件为：94，5min；40 个 PCR 循环(94，30s；57，30s；72，45s)。结果计算采用2-CT的计算方法5。1.7 统计学分析实验数据以 s 表示，采用 SPSS16.0 对实验结果进行统计学分析，组间差x异比较采用单因素方差分析。2 结果2.1 烟雾吸入后不同时相点肺组织病理学改变烟雾吸入后大鼠肺组织病理改变主要表现为肺间质水肿，弥漫性出血，肺泡腔内大量红细胞渗出和淋巴细胞的浸润，肺泡塌陷，其中 24h 组损伤最为严重；72h 和 7d 组可见部分肺泡壁断裂，肺泡腔增大形成肺大泡，出血和炎性渗出相对减少，在增宽的肺泡间隔内及小支气管周围可见梭形的成纤维细胞增生明显，并观察到肉芽肿的形成。各损伤组均可观察到黑色颗粒物的沉积，1h、6h 和 24h 组主要沉积在小支气管内，72h 和 7d 组颗粒物呈弥漫性分布沉积在小
