普通生物化学实验

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1、生物化学基础实验 教学课件,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,生化与分子生物学实验室 于乐军,目录,实验一 生物化学实验技能培训实验二 蛋白质部分性质实验实验三 Folin-wu法定量测定血糖的含量实验四 Folin-酚试剂法测定蛋白质浓度实验五 氨基酸的纸层析实验六 醋酸纤维薄膜电泳血清蛋白实验七 胰蛋白酶的活力测定实验八 酵母RNA的提取及鉴定 实验九 DNA的定量测定 实验十 水果中维生素C的定量测定实验十一 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳牛血清,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,生物化学实验技能培训,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实

2、验室,通过生物化学实验应该做到：, 学习设计一个实验的基本思路，掌握各个实验的基本原理，学会严密地组织自己的实验，合理地安排实验步骤和时间。 训练实验的动手能力，学会熟练地使用各种生物化学实验仪器。 学会准确翔实地记录实验现象和数据的技能，提高实验报告的写作能力，能够整齐清洁地进行所有的实验，培养严谨细致的科学作风。 掌握生物化学的各种基本实验方法和实验技术，为今后参加科研工作打下坚实的基础。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,实验室规则, 实验前必须认真预习实验内容，明确本次实验的目的和要求，掌握实验原理。 实验时自觉遵守实验室纪律，保持室内安静，不大声说笑和喧哗。 实

3、验过程中要听从教师指导，认真按照实验步骤和操作规程进行实验。若想改进和设计新的实验方法，必须取得教师的同意。实验时认真进行实验记录，实验完毕及时整理数据，按时上交实验报告。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室, 实验台面、称量台、药品架、水池以及各种实验仪器内外都必须保持清洁整齐，药品称完后立即盖好瓶盖放回药品架，严禁瓶盖及药勺混杂，切勿使药品（尤其是NaOH）洒落在天平和实验台面上，毛刷用后必须立即挂好，各种器皿不得丢弃在水池内。 配制试剂按实验实际使用量配制，多余的重要试剂和各种有机试剂要按教师要求进行回收；昂贵试剂需要回收，不得丢弃。,中国海洋大学生物基础实验教学中心

4、生化与分子生物学实验室, 配制的试剂和实验过程中的样品，尤其是保存在冰箱和冷室中的样品，必须贴上标签、写上品名、浓度、姓名和日期等，放在冰箱中的易挥发溶液和酸性溶液，必须严密封口。 强酸强碱以及其他实验废液必须倒入废液桶。电泳后的凝胶和各种废物不得倒入水池，只能倒入废物桶。 使用贵重精密仪器应严格遵守操作规程。使用分光光度计时不得将溶液洒在仪器内外和地面上。仪器发生故障应立即报告教师，未经许可不得自己随意检修。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室, 实验室内严禁吸烟、饮水和进食， 严禁用嘴吸移液管和虹吸管。易燃液体不得接近明火和电炉，凡产生烟雾、有害气体和不良气味的实验，均

5、应在通风条件下进行。 实验完毕必须及时洗净并放好各种玻璃仪器，插好自动部分收集器上的试管，保持实验台面和实验柜内的整洁。 严禁抄拿他组仪器，不得将器皿遗弃在分光光度计内和其他实验台面上，打破了玻璃仪器要及时向教师报告，并自觉登记，学期结束时按规定进行处理。 每日实验完毕，值日生要认真做好实验室的卫生值日工作。最后离开实验室的实验人员，必须检查并关好水、电、门、窗。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,蛋白质部分性质实验蛋白质颜色反应和沉淀反应,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,蛋白质分子中某种或某些集团可与显色剂作用，产生颜色。不同的蛋白质由于所含的氨

6、基酸不完全相同，颜色反应亦不完全相同。颜色反应不是蛋白质的专一反应，一些非蛋白物质也可产生同样的颜色反应，因此不能根据颜色反应的结果来决定被测物是否为蛋白质。另外，颜色反应也可作为一些常用蛋白质定量测定的依据。,第一部分 蛋白质的颜色反应,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,一、试验原理,二、实验仪器 1、吸管 2、滴管 3、试管 4、电炉 5、pH试纸 6、水浴锅 三、实验试剂 1、卵清蛋白液：鸡蛋清用蒸馏水稀释10-20倍，3-4层纱布过滤，滤液放在冰箱里冷藏备用。 2、 0.5%苯酚：1g苯酚加蒸馏水稀释至200ml。 3、Millons试剂：40g汞溶于60ml浓硝

7、酸（水浴加温助溶）溶解后，冷却，加二倍体积的蒸馏水，混匀，取上清夜备用。此试剂可长期保存。 4、1%CuSO4：1g CuSO4晶体溶于蒸馏水，稀释至100ml 5、10%NaOH：10g NaOH溶于蒸馏水，稀释至100ml 6、0.1%茚三酮溶液：0.1g茚三酮溶于95%的乙醇并稀释至100ml. 7、尿素晶体 8、浓硝酸 9、冰醋酸 10、浓硫酸,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,（一）米伦（Millons）反应原理：米伦试剂是硝酸、亚硝酸、硝酸汞、亚硝酸汞的混合物。他能与苯酚及某些二羟基苯衍生物起颜色反应。组成蛋白质的氨基酸中只有酪氨酸含苯酚基团，因此该反应为蛋白

8、质中酪氨酸存在的依据。 操作：1、苯酚实验：取0.5%苯酚溶液1ml于试管中，加Millons试剂0.5ml，于电炉上小心加热，溶液即出现玫瑰红色。2、蛋白质实验：取2ml蛋白液，加Millons试剂0.5ml，出现白色的蛋白质沉淀，小心加热，凝固的蛋白质出现红色。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,四、实验步骤,（二）双缩脲反应原理：尿素被加热，则两分子的尿素放出一分子氨而形成双缩脲。双缩脲在碱性环境中，能与硫酸铜结合成紫色的化合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中含有肽键与缩脲结构相似，故也能进行此反应。双缩脲反应可作为蛋白质定量测定的依据。 操作：1、尿素实验取少

9、量尿素晶体放在干燥的试管中，微火加热使其熔化成液体，此时有氨气放出，可用湿润的试纸检验，至液体重新结晶出现白色固体时，停止加热，冷却。然后加10%NaOH溶液1ml，摇匀，再加2-4滴1% CuSO4溶液，混匀，观察有无紫色出现。2、蛋白液实验取蛋白液1ml，加10%NaOH溶液1ml，摇匀，再加2-4滴1% CuSO4溶液，混匀，观察有无紫色出现。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,（三）黄色反应原理：蛋白质分子中含有苯环结构的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等），于浓硝酸可反应并生成黄色物质，此物质在碱性环境下变为桔黄色的硝基苯衍生物硝醌酸等。操作：取一支试管，加入1ml蛋白

10、液及浓硝酸5滴。加热，冷却后注意颜色变化。然后再加入10%NaOH溶液1ml，颜色有什么变化？,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,（四）茚三酮反应原理：蛋白质与茚三酮共热，产生兰紫色的还原茚三酮、茚三酮和氨的缩合物。此反应为一切蛋白质及a-氨基酸所共有。亚氨基酸（脯氨酸和羟脯氨酸）与茚三酮反应呈黄色，含有氨基的其他物质亦呈此反应。 操作：取蛋白液1ml于试管中，加4-8滴茚三酮溶液，加热至沸，即有蓝紫色出现。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,第二部分 蛋白质的沉淀反应,一、试验原理蛋白质是亲水性胶体，在溶液中的稳定性与质点大小、电荷、水化作用有关，

11、但其稳定性是有条件的，相对的。如果条件发生了变化，破坏了蛋白质的稳定性，蛋白质就会从溶液中沉淀出来。,蛋白质胶体溶液的稳定因素：水化膜、带电荷。当破坏这两个因素时，蛋白质中从溶液中析出而产生沉淀。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,二、实验仪器 1、移液管 2、吸管 3、试管 4、电炉 三、实验试剂 1、卵清蛋白液：鸡蛋清用蒸馏水稀释10-20倍，3-4层纱布过滤，滤液放在冰箱里冷藏备用。 2、饱和硫酸铵溶液：100ml蒸馏水中加硫酸铵至饱和。 3、硫酸铵晶体：用研钵研成碎末。 4、95%乙醇。 5、醋酸铅溶液：1g醋酸铅溶于蒸馏水并稀释至100ml 6、硫酸铜溶液：1g

12、 CuSO4晶体溶于蒸馏水，稀释至100ml 7、氯化钠晶体 8、10%三氯乙酸溶液：10g三氯乙酸溶于蒸馏水中并稀释至100ml 9、饱和苦味酸溶液：100ml蒸馏水中加苦味酸至饱和。 10、1%醋酸溶液。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,四、实验步骤 （一）蛋白质的盐析作用 原理：向蛋白质中加入大量的中性盐（硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等），使蛋白质胶体颗粒脱水，破坏其水化层，同时它所带有的电荷亦被中性盐上所带的相反电荷的离子所中和。于是稳定因素被破坏，蛋白质聚集沉淀。盐析作用一般不使蛋白质变性。 操作：1、取试管1支，加蛋白液2ml，然后加固体硫酸铵(加的过程要缓慢，加

13、的量要少随时摇匀），直至其饱和（大约为50%）。摇匀静置数分钟，则有球蛋白析出。2、将上述混合液过滤。向滤液中逐渐加入少量固体硫酸铵（每次加入量约为米粒大小），边加边摇，直至饱和为止，此时析出为清蛋白。再加入少量蒸馏水，观察沉淀是否溶解。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,（二）有机溶剂沉淀蛋白质 原理：某些有机溶剂（如乙醇、甲醇、丙醇等），因引起蛋白质脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点间的相互作用，致使蛋白质颗粒容易凝聚而沉淀。 操作：取一试管加蛋白液1ml，加入晶体氯化钠少许，待溶解后再加95%乙醇3ml,摇匀，观察现象。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与

14、分子生物学实验室,（三）重金属盐与某些有机酸沉淀蛋白质原理：重金属离子（如Pb2+、Cu2+等）与蛋白质的羧基等结合生成不溶性的金属盐类而沉淀，同时蛋白质发生变性。某些有机酸的酸根则与蛋白质的自由氨基结合而沉淀。操作：1、取试管2支，各加蛋白液2ml，一支管中滴加1%醋酸铅溶液，另一支管中滴加1%硫酸铜溶液，至有沉淀产生。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,（四）生物碱试剂沉淀蛋白质 原理：植物体内具有显著生理作用的含氮碱性化合物成为生物碱。能沉淀生物碱或与其产生颜色反应的物质称为生物碱试剂，如鞣酸等。当溶液PH小于等电点时，蛋白质颗粒带正电荷，容易与生物碱试剂的负离子发

15、生反应而沉淀。 操作：取2支试管，分别加入蛋白液2ml及醋酸4-5滴，再加饱和苦味酸和鞣酸数滴，观察现象。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,（一） 米伦（Millons）反应 1、苯酚实验：取0.5%苯酚溶液1ml于试管中，加Millons试剂0.5ml，电炉小心加热观察颜色变化。 2、蛋白质实验：取2ml蛋白液，加Millons试剂0.5ml，出现白色的蛋白质沉淀，小心加热，观察现象。 （二） 双缩脲反应 1、取少量尿素晶体放在干燥的试管中，微火加热熔化，至重新结晶时冷却。然后加10%NaOH溶液1ml，摇匀，再加2-4滴1% CuSO4溶液，混匀，观察现象。2、取蛋

16、白液1ml，加10%NaOH溶液1ml，摇匀，再加2-4滴1% CuSO4溶液，混匀，观察现象。 （三） 黄色反应取一支试管，加入1ml蛋白液及浓硝酸5滴。加热，冷却后注意颜色变化。然后再加入10%NaOH溶液1ml，颜色有什么变化？ （四） 茚三酮反应取蛋白液1ml于试管中，加10滴茚三酮溶液，加热至沸，即有蓝紫色出现。,（一）蛋白质的盐析作用 1、取试管1支，加蛋白液2ml，然后加固体硫酸铵(加的过程要缓慢，加的量要少，随时摇匀），直至其饱和（大约为50%）。摇匀静置数分钟，则有球蛋白析出。2、将上述混合液过滤。向滤液中逐渐加入少量固体硫酸铵，直至饱和为止，此时析出为清蛋白。再加入少量蒸馏水，观察沉淀是否溶解。 （二）有机溶剂沉淀蛋白质 试管中加蛋白液1ml，加晶体氯化钠少许，溶解后加95%乙醇3ml,摇匀，观察现象。 （三）重金属盐与某些有机酸沉淀蛋白质 1、取试管2支，各加蛋白液2ml，一支管中滴加1%醋酸铅溶液，另一支管中滴加1%硫酸铜溶液，至有沉淀产生。 2、取一支试管加蛋白液2ml，再加入10%三氯乙酸1ml，充分混匀，观察结果。 （四）生物碱试剂沉淀蛋白质 取一支试管，加入蛋白液2ml及醋酸4-5滴，再加饱和苦味酸数滴，观察现象。,