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1、l2012 届攻读学士学位本科生毕业论文届攻读学士学位本科生毕业论文人工诱导龙血竭龙血素人工诱导龙血竭龙血素 B 含量的测定含量的测定学学 院院 中中 药药 学学 院院 学生姓名学生姓名 专专 业业 中中 药药 资资 源源 与与 开开 发发 实习单位实习单位 广东石岐制药有限公司广东石岐制药有限公司 导师姓名导师姓名 二零一一年十月二五日二零一一年十月二五日人工诱导龙血竭龙血素人工诱导龙血竭龙血素 B B 的含量测定的含量测定第 1 页 共 11 页目目录录摘要摘要 1前言前言 2实验材料实验材料 3方法与结果方法与结果 4讨论讨论 10参考文献参考文献 10致谢致谢 11人工诱导龙血竭龙血素
2、人工诱导龙血竭龙血素 B B 的含量测定的含量测定第 2 页 共 11 页人工诱导龙血竭龙血素人工诱导龙血竭龙血素 B 的含量测定的含量测定实习学生： （2008 级 中药资源与开发班） 指导教师： 摘摘 要：要：目的目的：对人工诱导龙血竭与其基源植物的化学成分进行比较研究，为人工诱导龙血 竭是否能替代其基源植物提供基础数据；方法方法：采用 RP-HPLC 法。选用 Waters Nova-Pak C18 色谱柱(3.9 mm150 mm，i.d，5m)，检测波长 278 nm，柱温 40，以乙腈-0.4%磷酸（30：70) 为流动相；流速 1.0 ml/min。结果结果：自然生长龙血竭和人工
3、诱导龙血竭均具有相对保留时间 14.2 和 19.9 的两个共有峰，且峰形相似度较高。结论结论: 可以推测人工诱导龙血竭和其基源植物化学 成分较为接近，但仍须结合药理学实验对其差异进行进一步研究。 关键词：关键词：龙血竭；人工诱导；高效液相；龙血素 B.Determination of loureirin B in Artificial induction Dragons blood【Abstract】Objective: The Dragons Blood comparative studies on the artificial induction and original plants
4、of chemical constituents, in order to provide the basic data whether artificially induced Dragons Blood replace the original plants. Methods: The HPLC method was established. The chromatographic column was Waters Nova-Pak C18(3.9mm150mm，i.d，5m). The mobile phase was used with acetonitrile-0. 4% phos
5、phoric acid(30:70). and the detection wavelength was 278 nm. The flow rate was 1. 0 ml/min and the temperature of column was 40 .Results: The natural growth and artificially induced Dragons Blood own two peaks of the relative retention time at 14.2 and 19.9, and keep similar peak shapes.Conclusion:
6、This can be speculated that the chemical composition of artificial induction keep closer to the base plant, but would still combined with pharmacological experiments to further study their differences.【Key words】Dragons Blood，Artificial induction，HPLC，loureirin B.1、前言、前言龙血竭为传统名贵中药 ,主要在明清以前使用。明清后使用主要
7、为棕榈科龙血树所产血竭又名麒麟竭、竭留、海蜡等 ,是中医常用的活人工诱导龙血竭龙血素人工诱导龙血竭龙血素 B B 的含量测定的含量测定第 3 页 共 11 页血散淤和止血药 ,其性平,味甘、温、咸 , 平，归心、肝经，具有良好的活血散淤、定痛止血、生肌敛疮等功效 ,主要用于外伤出血、溃疡不敛、跌打损伤、淤滞等症 ,有“活血之圣药”的美誉(明李时珍本草纲目卷34)。20世纪70年代起，在云南孟连、沧源、勐腊等地发现能够提供血竭的相似野生植物资源剑叶龙血树，从而真正开始了国产血竭的生产和应用，国内药材名称为龙血竭（见国家部颁标准WS3-082(Z-016)-99(Z)）。龙血竭（Dragons b
8、lood）主要来源于龙舌兰科(现合并到百合科)龙血树属或其它科属植物的树脂，是龙血树树干受到损伤后，在一定的生态条件下，经微生物浸染，发生生理生化转化，使内皮层和髓部逐渐转变为红色树脂。龙血竭的形成是龙血树对外界因子胁迫和刺激作用的积极响应，是一个以次生代谢产物为分子基础的复杂的生理生态过程。目前龙血竭的运用越来越广泛，特别是在治疗冠心病、脑梗塞、上消化道出血和妇科血症等方面取得了显著疗效。随着我国龙血竭资源的开发利用，龙血竭需求量增加，野生龙血树资源遭到了严重破坏，目前龙血树已被定为国家二级保护植物，因此对大规模生产造成了极大的限制。所以王兴红等经实验发现血竭的形成与树体的损伤及真菌的侵染有
9、密切的关系,是龙血树抵抗微生物侵染的一种防御反应。龙血树死后,其木质受到某些微生物侵染时仍然能形成抑制微生物生长的血竭。因此，对人工诱导产的龙血竭进行含量测定研究以评价其药用价值的优劣对我国龙血竭资源和药物的开发利用具有重要意义。本实验采用 RP-HPLC 色谱法，结合对照品龙血素 B 建立人工诱导龙血人工诱导龙血竭龙血素人工诱导龙血竭龙血素 B B 的含量测定的含量测定第 4 页 共 11 页竭与其基源植物的 HPLC 指纹图谱分析方法,阐明两者之间的差异，为人工诱导龙血竭是否能替代其基源植物提供基础数据。2、实验材料、实验材料2.1 化学试剂材料化学试剂材料氯仿（上海化学试剂有限公司生产）
10、乙酸乙酯（上海化学试剂有限公司生产）甲醇(色谱纯)，乙腈(色谱纯),磷酸(分析纯)，石油醚（分析纯）龙血素 B 对照品(中国生物制品检定所提供)2.2 植物样品植物样品样品为自然生长型龙血竭(龙舌兰科剑叶龙血树) 和人工诱导型龙血竭（云南大学微生物研究所提供）2.3 主要设备及仪器主要设备及仪器电子天平（型号 BS124S Sartorius; d=0.0001g）高效液相色谱仪 旋转蒸发仪索式提取器 容量瓶（10ml） 、量筒等。2.4色谱条件色谱条件色谱柱采用 Waters Nova-Pak C18 色谱柱(3.9 mm150 mm，5 m)，检测波长 278 nm，柱温 40，进样量 1
11、0 l，以乙腈-0.4%磷酸（30:70)为流动相；流速 1.0 ml/min。3、方方法法与与结结果果3.1 鉴鉴别别(1)取本品粉末 5g，加氯仿 25ml，置水浴中加热回流 30 分钟，放冷，滤过，滤液浓缩至适量。加硅胶 2g，拌匀，蒸干，研匀。加于硅胶柱上(玻璃柱，内径 10mm，硅胶 3g，100200 目，干法装柱)，用石油醚(6090)-氯仿(5:1)的混合溶液 30ml 洗脱，收集洗脱液，蒸干。残人工诱导龙血竭龙血素人工诱导龙血竭龙血素 B B 的含量测定的含量测定第 5 页 共 11 页渣加氯仿 0.5ml 使溶解，作为供试品溶液。另取剑叶龙血素 C，加氯仿制成每 1ml 含
12、 2mg 的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典1995 年版一部附录 B)试验，吸取上供试品溶液 20l，对照品溶液10l，分别点于同一含羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶 HF254 薄层板上。以石油醚(6090)-氯仿(20:1)为展开剂,展开，取出，晾干。置紫外光灯(254nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置下，显相同颜色的斑点。(2)取本品粉末 0.5g，置索氏提取器中，加石油醚(6090)70ml，水浴中加热回流 1 小时。提取液置水浴上蒸干，残渣加氯仿 1ml 使溶解，作为供试品溶液。另取龙血竭对照药材 0.5g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典 1
13、995 年版一部附录 B)试验，吸取上述两种溶液 24l，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶 H 薄层板上，以氯仿-甲醇(99:1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以硫酸乙醇溶液(110)，在 105加热 510 分钟。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。(3)取鉴别(2)项下石油醚提取后的不溶物,挥尽石油醚，置索氏提取器中，加醋酸乙酯 70 ml，水浴回流 1 小时。提取液浓缩至约 5 ml，加聚酰胺 2g，拌匀，蒸干，置于已处理好的聚酰胺柱上(玻璃柱，内径 10 mm，1430 目，5g，湿法装柱)，以 50%乙醇 100 ml 洗脱(流速 1.5 ml/m
14、in)，洗脱液弃去，继以乙醇 50 ml 洗脱(流速 1.5 ml/min)，收集洗脱液，水浴蒸干，残渣加氯仿 10 ml 使溶解，滤过，滤液蒸干，残渣加氯仿 1ml 使溶解，作为供试品溶液。另取龙血竭对照药材 0.5g，同法制成人工诱导龙血竭龙血素人工诱导龙血竭龙血素 B B 的含量测定的含量测定第 6 页 共 11 页对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典 1995 年版一部附录 B)试验，吸取上述两种溶液各 46l，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶 H 薄层板上，以石油醚(6090)-醋酸乙酯(10:1)为展开剂，展开,取出，晾干，喷以 10%磷钼酸乙醇溶液。在 105加热约 5
15、 分钟。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。3.2 结果结果3.2.1对照品溶液的制备对照品溶液的制备精密称取龙血素 B 对照品适量，加甲醇溶解，使成每 1ml 中含龙血素 B 0.024mg 溶液，作为对照品溶液。进样量 10 l,见图 1图 1 龙血素 B 色谱图3.2.2供试品溶液的制备供试品溶液的制备称取人工诱导龙血竭与自然生长型龙血竭 1 g，精密称定，加硅藻土 2g，混匀，置索氏提取器中，加氯仿 100ml，置水浴中加热回流 6 小时，提取液减压浓缩至近干，加醋酸乙酯适量使溶解。移置 10 ml 量瓶中，用醋酸乙酯洗涤容器并稀释至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，收集续滤液作为供试品溶液。3.2.3方法学考察方法学考察人工诱导龙血竭龙血素人工诱导龙血竭龙血素 B B 的含量测定的含量测定第 7 页 共 11 页精密度实验精密度实验取龙血竭同一供试品溶液，连续进样 6 次，考察各色谱峰相似度的一致性，测得其各色谱峰相对峰面积的 RSD3%，相对保留时间的RS
