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1、,主要内容,第六节 条件突变株的应用第七节 选育不生产副产物菌株第八节 选育生产代谢拮抗物菌株,条件突变株的应用,突变：通过DNA中碱基变化（即一级结构的变化） 导致生物性状发生改变的现象。 条件突变：一种突变在一定条件下表现为野生表型，但在特殊条件下出现突变表型。如：温度敏感性突变抑制性突变链霉素依赖性突变低温敏感性突变,温度敏感突变株,温度敏感突变株：在正常培养温度下，菌体生长良好，当温度提高到一定程度时（如30提高到40），停止生长，而只产酸的菌株。 典型应用：谷氨酸发酵谷氨酸敏感突变株的突变位置是发生在决定与谷氨酸分泌有密切关系的细胞膜结构的基因上，发生碱基的转换或颠换，一个碱基为另一
2、个碱基所置换，这样由基因所指导释放出的酶，在高温下失活，导致细胞膜某些结构的改变。,谷氨酸发酵,正常情况下：谷氨酸产生菌的细胞膜不允谷氨酸细胞内渗透到细胞外，在发酵过程中，一般是通过控制生物素亚适量、添加 tween-60或青霉素等手段来调节细胞膜的渗透性，以使谷氨酸产生菌细胞膜允许谷氨酸从细胞内渗透到细胞外。 谷氨酸温度敏感突变株发酵：仅需通过转换培养温度就可以完成谷氨酸生产菌由生长型细胞向产酸型细胞的转变，避免了因原料影响而造成产酸不稳定的现象，且发酵稳定，发酵周期短，设备利用率高。另外生物素可以大过量，从而强化二氧化碳固定反应，提高糖酸转化率,温度敏感突变株发酵谷氨酸,关键点：A.控制好
3、温度转换时间B.适度的剩余生长 温度转换的最佳时间因菌株，接种量，培养基组成和发酵条件而异。转换时间不同，产酸显著变化。 在温度转换之后，必须进行适度的剩余生长，完成谷氨酸非积累型细胞向谷氨酸积累型细胞的转变。剩余生长太多，意味着细胞未能进行有效的生理变化，剩余生长太少，意味着细胞没有机会完成这种转变。,选育不生产副产物菌株,1.有共用前体物的其他分支途径或目的产物是其他产物生物合成的前体物时，应附加营养缺陷型，切断其他分支途径或目的产物是其他产物生物合成的代谢流。 2.存在有目的产物分解途径时，应选育丧失目的产物分解酶的突变株。 3.当有副生产物，特别是有不利于目的产物精制的副生产物时，应设
4、法切断副生产物的代谢流（丧失副生产物生物合成途径中的某个酶）,选育生产代谢拮抗物菌株,代谢拮抗物：与代谢产物结构相似，同样能与阻遏物以及变构酶相结合，可是它们往往不能代替正常的氨基酸而合成为蛋白质，它们在细胞中的浓度不会降低，因此与阻遏物以及变构酶的结合是不可逆的。这就使得有关的酶不可逆地停止了合成，或是酶的催化作用不可逆地被抑制。,正亮氨酸积累机制,正亮氨酸积累机制,由Leu产生菌诱导了Ile、Val生物合成酶系有缺陷的突变株，在Thr的培养基中发酵，结果Thr转化成-KB，不去合成Ile，却积累了Nva，同时副生Nle。Nle是由Nva前体物-KV经Leu生物合成系生成的。,正亮氨酸积累机
5、制,Nle来自Nva，是Met生物合成的假反馈控制剂，添加Met，可回复生长，积累Nle。通过选育自我抗性，即赋予Nle抗性，可以育出在不添加Met的培养基中生产Nle的菌株。在该抗性菌株中，蛋氨酸合成酶已被去阻遏。,L-异亮氨酸生产,方法：提取法、化学合成法、发酵法 发酵法：添加前体发酵、直接发酵法 直接发酵法：借助微生物具有合成自身所需氨基酸 的能力，通过菌株的诱变处理，选育出各种营养缺陷型和氨基酸结构类似物抗性突变株，如黄色短杆菌，以解除代谢调节中的反馈抑制和反馈阻遏，达到过量积累L-Ile的目的。,L-异亮氨酸生产,L-异亮氨酸生产,谷氨酸棒杆菌：谷氨酸比天冬氨酸优先合成，谷氨酸在细胞
6、内积累到一定浓度后，反馈抑制谷氨酸脱氢酶，是细胞的代谢转向天冬氨酸。 黄色短杆菌：蛋氨酸优先合成，蛋氨酸过剩时，会反馈阻遏高丝氨酸转乙酰酶的合成，转而合成苏氨酸和异亮氨酸。 AK受赖氨酸和苏氨酸的协同反馈抑制，切断赖氨酸的合成途径，可以积累苏氨酸，最终使异亮氨酸浓度提高。,L-异亮氨酸生产,苏氨酸是异亮氨酸的前体物，设法解除对苏氨酸生物合成的反馈控制，增强苏氨酸的生物合成，可以增加异亮氨酸的积累。 另外，通过切断支路代谢选育营养缺陷型突变菌株，或通过解除反馈调节选育结构类似物抗性突变株，均可提高产生菌积累异亮氨酸的能力,L-异亮氨酸生产,选育蛋氨酸营养缺陷型可切断合成蛋氨酸的支路，提高菌株L-异亮氨酸的合成能力。利用氨基酸结构类似物如-氨基-羟基戊酸(AHV)、异亮氨酸氧肟酸(IleHx),-氨基丁酸(-AB)等抗性突变株解除L-异亮氨酸代谢过程中的反馈抑制，可提高L-异亮氨酸的积累,Thank you,
