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1、1,第十二章 荧光分析法,2,3,4,5,光致发光物质受到光的照射时，除吸收某种波长的光还会发射出比原来所吸收的波长更长的光的现象。 荧光物质分子接受光子能量被激发后，从激发态的最低振动能级返回基态时所发射的光。分子荧光和原子荧光,6,第一节 荧光分析法的基本原理,电子能级的多重性 M=2s+1 M=1 单重态 M=3 三重态,一、分子荧光,（一）分子荧光的产生,1. 分子的电子能级与激发过程,M=1,M=1,M=3,2. 荧光的产生,8,振动驰豫激发态各振动能级的分子通过碰撞释放能量，返回同一电子激发态的最低振动能级的过程。 内部能量转换当两电子激发态能量相差较小以致其振动能级有重叠时，受激
2、分子由高电子能级转移致低电子能级的过程。（振动失活在同样多重态间进行，如S2* S1*）,术 语,9,外部能量转换激发态分子与溶剂或其它溶质碰撞，以热能的形式释放能量的过程。 体系间跨越处于激发态分子的电子发生自旋反转而使分子的多重性发生变化的过程，如S1* T1*,术 语,10,荧光发射第一激发单重态的最低振动能级 基态（任一振动能级）发射荧光的过程约为10-910-7s 磷光发射激发三重态的最低振动能级 基态（任一振动能级）发射磷光的过程约为10-410s或更长磷光法不如荧光法普遍,11,（二）荧光的激发光谱和发射光谱,激发光谱（形状与吸收光谱相似）固定某一发射波长，测定该波长下荧光发射强
3、度随激发波长变化所得的光谱。荧光强度激发波长 发射光谱（荧光光谱）固定某一激发波长，测定荧光发射强度随发射波长变化所得的光谱。 荧光强度发射波长 定性？,萘的激发光谱及荧光和磷光的发射光谱,12,荧光光谱特征,苝的苯溶液（a）和硫酸奎宁的稀硫酸溶液（b） 吸收光谱和荧光发射光谱,13,1. 斯托克斯位移荧光发射波长总是大于激发波长的现象 1852 Stokes 位移 2. 荧光发射光谱与激发波长无关荧光发射光谱只有一个发射带第一激发单重态的最低振动能级基态各振动能级 3. 荧光光谱与激发光谱的镜像关系基态与激发态的振动能级间隔类似激发光谱：基态激发态各振动能级荧光光谱：激发态基态各振动能级,溶
4、液荧光光谱特征,14,二、荧光与分子结构,荧光寿命除去激发光源后，分子的荧光强度降低到最大荧光强度的1/e所需的时间，用f 表示。 以lnF0/Ft 作图，直线斜率即为1/ f。,（一）荧光寿命和荧光效率,15,荧光效率,物质的荧光效率在01之间，0.11时有分析价值。 fai,16,（二）有机化合物分子结构与荧光的关系,物质发射荧光的两个条件：强的紫外吸收、 一定的荧光效率一般地，大多数荧光物质受到激发后，首先经历*或n*跃迁，经过振动驰豫或其它无辐射跃迁，再发生*或*n跃迁，产生荧光。由于*比n*跃迁的强度更大，寿命更短，因此*常能产生较强的荧光。虽然n*跃迁产生的荧光较*弱，但在发生n*
5、跃迁时，紧接着产生体系间跨越，最后从*三重态回到基态，产生更强的磷光。,17,1. 长共轭结构,能产生荧光的物质大都含有芳香环或杂环，或是长共轭双键的脂肪烃 共轭效应增大了荧光物质的摩尔吸收系数，有利于产生更多的激发态分子，从而有利于荧光的产生,苯 ex 205nm em 278nm 0.11,萘 ex 286nm em 321nm 0.29,蒽 ex 356nm em 404nm 0.36,18,2. 分子的刚性,分子的刚性越强，荧光效率越大,联苯 0.2,芴 1.0,无荧光,有荧光,19,3. 取代基,给电子取代基常使荧光强度增大如：-NH2、-OH、-OCH3、-NHR、-NR2、-CN
6、等 吸电子取代基常使荧光强度降低如：-COOH、-NO、-NO2、 -SH、 RCO-等 卤素取代基随卤原子序数的增加而荧光下降 1-氯代萘 0.05 1-溴代萘 0.002 1-碘代萘 0.000可能是由 “重原子效应”所致。在重原子中，能级之间的交叉现象比较严重，容易发生自旋轨道的相互作用，增加了体系间跨越的速度。,20,（三）荧光试剂,作用：产生强荧光性产物 1. 荧光胺 2. 邻苯二甲醛 3. 1-二甲氨基-5-氯化磺酰萘 4. 测定无机离子的荧光试剂,21,三、 影响荧光强度的外部因素,温度升高通常会使荧光效率和荧光强度降低 乙醇 -80C =1.00 温度每增加10C ，荧光效率减
7、小约3%,1. 温度,22,2. 溶剂,一般地，随极性溶剂的增加，荧光波长长移，荧光强度增强。奎宁在苯、乙醇和水中的荧光效率的相对大小为1、30、1000。 溶剂粘度减小，分子碰撞机会增加，荧光减弱。,23,3. 酸度,每一种荧光物质都有其最适宜的pH范围,24,下列中能使苯胺引起荧光熄灭的是（ ）A. 乙醇 B. 盐酸 C. 水 D. 硫酸,苯胺在（ ）条件下荧光强度最强 A. pH=1 B. pH=3 C. pH=10 D. pH=13,C,BD,25,4. 荧光熄灭剂,荧光熄灭（荧光猝灭）荧光强度降低的现象 荧光熄灭剂卤素离子、重金属离子、氧分子、硝基化合物、重氮化合物、羰基化合物等等
8、荧光熄灭原因分子碰撞失去能量、生成不发光的物质、氧的熄灭作用、自熄灭和自吸收,26,由于氧分子的顺磁性质，溶液中溶解氧的存在，使激发单重态分子向三重态的体系间跨越速率增加，因而会使荧光效率降低。其它顺磁性物质也有这种作用。,碰撞熄灭,能量转移,氧的熄灭作用,27,5. 散射光,散射光子与物质相碰撞，使光子的运动方向发生改变而向不同的方向散射。 瑞利散射光子和物质分子发生弹性碰撞，只有光子运动方向发生改变的散射光，其波长与入射光波长相同。 拉曼散射光子和物质分子发生非弹性碰撞，光子运动方向发生改变的同时，光子与物质发生能量交换，发射出比入射光更长或更短的散射光。,28,溶剂中杂质的荧光光谱或溶剂
9、的拉曼光谱可能干扰测定。 溶剂在不同波长的激发光照射下，其拉曼光的波长随激发光波长的变化而变化，而物质的荧光波长不变，所以可以通过选择适当的激发波长来消除拉曼光的干扰。,29,荧光法测定硫酸奎宁时，激发光波长若选择在320nm，拉曼光波长为360nm；若激发光波长选择在350nm，拉曼光波长为400nm。荧光波长为448nm。则测定时选择波长应为（） A. ex320nm em 400nm B. ex320nm em 360nm C. ex350nm em 448nm D. ex320nm em 448nm,30,第二节 荧光定量分析方法,一、荧光强度与物质浓度的关系,低浓度时呈现良好的线形关
10、系 ecl 吸光度,31,二、定量分析方法,1. 校正曲线法 FC 2. 比例法 （空白不能调零时，要扣除空白）3. 联立方程式法（紫外可见光）,32,第三节 荧光分光光度计和分析新技术,滤光片荧光计 滤光片单色器荧光计 荧光分光光度计,荧光分光光度计结构示意图1.光源 2、4、7、9. 狭缝 3.激发单色器 5.样品池 6.表面吸光物质 8.发射单色器 10.检测器 11.放大器 12.指示器 13.记录器,源发光源（氙灯）、激发单色器、样品池、发射单色器、检测系统,一、荧光分光光度计,1. 主要部件,在测量分子荧光强度时，要在与入射光成直角的方向上进行测量，这是由于（ ） A. 只有在入射
11、光线成直角的方向上才有荧光 B. 荧光强度比透射光强度小 C. 荧光强度比透射光强度大 D. 荧光波长比透射光波长长 E. 荧光是向各个方向发射的，为了减小透射光的影响,荧光分光光度计常使用的光源是（ ） A. 空心阴极灯 B. 氙灯 C. 氢灯 D. 硅碳棒,B,E,35,2. 仪器的校正,（1）灵敏度的校正一定浓度的稳定荧光物质作对照品溶液调仪器（如1ug/ml硫酸奎宁） （2）波长校正汞灯的标准谱线 （3）激发光谱和荧光光谱的校正光源强度、检测器的感应度,36,3. 荧光分析法的应用,（1）无机化合物的分析 采用有机试剂进行荧光分析的元素已近70多种 能够与金属离子形成荧光络合物的有机试
12、剂绝大多数是芳香族化合物。（分子刚性平面结构增大） 另一类络合物是三元离子缔合物。例：罗丹明B为阳离子荧光染料，Au3+、Ga3+、Tl3+等阳离子首先与卤素离子形成二元络阴离子，再与罗丹明B缔合形成荧光化合物。 荧光猝灭法也是常采用的方法。,37,（2）有机化合物的分析,脂肪族有机化合物本身能发荧光的很少，需要与某些试剂反应后才能进行荧光分析 芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，多数能发生荧光，可直接用荧光法测定。对具有致癌活性的多环芳烃，荧光分析法已成为最主要的测定方法。 在生物化学分析、生理医学研究和临床、药物分析领域，许多重要的分析对象，如维生素、氨基酸和蛋白质、胺类、甾族化合物、酶和辅酶等，均可用荧光法分析。,38,二、荧光分析新技术简介,1. 激光荧光分析激光作光源；超低浓度分析 2. 时间分辩荧光分析利用不同物质的荧光寿命不同，在激发和检测之间延缓的时间不同来实现分别检测。 3. 同步荧光分析 4. 胶束增敏荧光分析,39,Thanks,
