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1、PCR方法快速检测HBV,指导教师:于红 张文卿 学 生:刘晓林 王远贺 王瑞静,一、实验背景知识,1、HBV与乙型肝炎【HBV结构】,【HBV致病性】HBV传播乙型肝炎的四种传播途径为:1、血液、血制品等医源性传播2、母婴传播3、生活密切接触传播4、性传播HBV与肝硬化、原发性肝癌关密切！,【血清HBV DNA检测】血清HBV DNA是HBV感染、复制、血液有传染性的直接标志。实验者综合PCR实验的优缺点，实验条件，选择应用PCR检测HBV。,二、实验原理,【PCR反应成分】1.模板DNA； 2.引物； 3.四种脱氧核糖核苷酸4.DNA聚合酶； 5.反应缓冲液、Mg2+等。,三、实验准备,【
2、实验材料】：引物：5TGACAAGAATCCTCACAATA35AGCCCTACGAACCACTGAAC3(扩增HBV的S基因，产物长度493bp)Pure ddH2O 10xbuffer 10xdNTP 25mM MgCl2 TaqDNA聚合酶 溴酚蓝 溴化乙锭 TBE缓冲液 琼脂糖 阳性标本一例 待测标本两例 阴性标本一例,【实验仪器】：PCR扩赠仪 水平式电泳槽 紫外透射仪 凝胶成像分析仪 微量加样器等,四、实验步骤,1、取一支Eppendorf管，按如下顺序和计量，依次加入。Pure ddH2O 112.2ml10xbuffer 18ml10xdNTP 18ml25mM MgCl2 1
3、0.8mlprimer1 3.6mlprimer2 3.6mlTaq DNA聚合酶 1.8ml,5、依次从五个Eppendorf管中取出扩增后的液体，以5：1的比例与溴酚蓝混合，依次加入凝胶孔中。另一孔中加入Mark 6、近凝胶孔侧接“”极，对侧接“+”极，电压80V,电泳30分钟. 7、取出凝胶,在紫外灯下观察结果.,五、实验结果,从右到左结果如下,【结果分析】8、9号标本为阳性标本。（结果解释：重复加入9号标本、阴性对照标本，是由于在向凝胶孔中加入样品时，防止滴加量少而不出结果。）,六、实验总结,【实验内容总结】1、PCR的灵敏度极高，在操作中应尽量避免。尤其实在向Eppendorf管加试剂时，更应格外小心，防止污染。2、当向每支Eppendorf管中加的试剂量十分少时，为避免误差，可各管中相同的材料加在一起，在等份分开。3、溴乙锭有毒，应戴手套，实验中注意保护自己。4、由于是第一次的独立实验，实验中对许多先进的仪器不了解，如紫外投射仪、凝胶成像分析仪，给实验结果的记录带来了麻烦。,感谢指导老师张老师、于老师，感谢辛苦的技术室老师！谢谢,
