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1、中国药典非无菌产品微生物检查：微生物计数法,方法科学性和灵活性： 1、方法适用性试验模拟样品污染微生物后进行方法试验性验证。 2、结果判定以变化范围进行规定，符合微生物计数规律。 3、采用更适宜的培养体系。 4、检验结果偏差调查。,修订后的检查法具有以下特点,概念更明确，体例更合理，与国际接轨又兼顾了国情：增加供试品对照组、 菌种采用CMCC、检验量同2010年版，微生物限度标准、 控制菌检查了保留部分生化试验。 . 计数法明确了中国药典2010年版未规定的事项。 计数法合理性、有效性、准确性得以充分体现， 结果更接近真实污染状况。如：加菌方式发生变化。 与美国、欧洲、日本药典协调后方法一致，
2、对于采用国际、国内两套体系 的生产企业在方法一致的前提下，检测结果具有可比性，,修订后的检查法具有以下特点,ICH协调案 是对方法的修订，不是直接转换ICH的方法。,修订依据,格式变化通用要求计数方法 试验菌液的制备和试验培养基适用性检查供试液的制备计数方法适用性试验供试品检查结果判断,主要内容,修订前：一个通则 微生物限度检查法修订后：三个通则非无菌产品微生物检查：微生物计数法非无菌产品微生物检查：控制菌检查法药品微生物限度标准标准部分合并一部和二部内容结果报告问题：【微生物限度】,格式变化,修订前 概述检验量供试液制备培养基适用性检查方法验证供试品检查. 修订后 概述计数方法培养基适用性检
3、查和计数适用性试验供试品检查.,格式变化,修订前 检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。 修订后 用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计，不适用于活菌制剂的检查。 检查法可采用替代检查方法，包括自动检测方法，但必须证明其替代方法等效于药典规定的检查方法。,适用范围,适用范围,嗜温性微生物：最适生长温度2543。腐生微生物：大多数细菌和真菌，从动物、植物或其他有机物吸取养料。寄生微生物：生活在获得生物体外或体内。嗜热性微生物：生长温度为45以上。嗜冷性微生物：温度为1018。污染药品的微生物最普遍的是嗜温性微生物。,10,参照ICH的整合修订,1、参照ICH协调案”非无菌药
4、品微生物限度检查：微生物计数法”进行的修订。 2 、菌数计数在药典一、二、三部附录中内容基本一致。 3、增加计数方法 4、修订内容 微生物计数定义、培养基及培养基适用性检查、方法验证试验、菌数计数结果判断等内容。,（1105）非无菌药品微生物限度检查：微生物计数法,环境的要求,应在无菌的环境下进行微生物计数的检查，符合微生物计数检 查的要求，单向流空气区域内进行。 检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的 措施不得影响供试品中微生物的检出。,微生物计数,计数方法选择原则 根据供试品理化特性和标准等因素进选择。 所选方法的供试品量必须充足, 保证试验结果能够判断供试品是否符合规定。
5、 所选方法经适用性试验确认。,微生物计数,微生物限度检查指导原则:供试液制备方法、抑菌成分的消除方法及需氧菌总数、霉 菌和酵母菌总数计数方法；应选择操作简便、快速的方法。应避免损伤污染的微生物。抑菌作用较强的供试品,在供试品溶液性状允许的情况下，应选薄膜过滤法。,试验菌液的制备和使用,试验菌液制备和使用应来自认可的国内外菌种保藏机构的标准菌株，或使用与标准菌株所有相关特性等效的商业派生菌株。使用时应依据中国药典 药品微生物实验规范指导原则的要求。,菌种编号CMCC 中国医学菌种保藏中心CMCC（F）真菌 CMCC（B）细菌 协调案ATCC 美国标准菌种收藏中心NCIMB 英国食品工业与海洋菌种
6、保藏中心NBRC 日本技术评价研究所生物资源中心 CIP 法国巴斯德研究所菌种保藏中心,菌 株 枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis CMCC(B)63501 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus CMCC(B)26003 铜绿假单胞菌(替代大肠埃希菌） Pseudomonas aeruginosa CMCC(B)10104 白色念珠菌 Candida albicans CMCC(F)98001 黑曲霉 Aspergillus niger CMCC(F)98003,试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得 的冷冻干燥菌种为第0代）。 采用适宜的菌种
7、保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物 学特性。,冷冻保藏：长期储藏方法， 一般在低于-30或-70冰箱内 保藏 需要加入保护剂，如甘油。 冻干法保藏：长期保藏方法 。例如冻干菌种。 冷藏： 短期储藏方法。在28的冰箱保藏 。,新鲜菌液制备,的菌液基本要求 新鲜菌液：微生物保持旺盛的生命活力。 切实可行、快速稳定的菌液制备标准程序。 采用适宜的保存方法,不可重复从菌种包装瓶中移取菌种或重 新冷冻菌种。 传代代数（每接种一次即为一代）。,新鲜培养物制备用培养基,菌液制备,菌液贮存,修订前 修订后菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2-8可在24小时内使用。稳定的黑曲孢子悬液可保存
8、在2-8，在验证过的贮存期内使用。,培养基,培养基适用性检查,目的：确定培养基质量是否符合检验用要求。 培养基的无菌性试验 培养基的灵敏度试验 培养基适用性检查 -促生长试验 -抑制性试验 -指示能力,2018/9/9,31,计数方法的增修订内容,微生物计数方法,倾注法 方法 取供试液1ml，置直径90mm的无菌平皿中, 注入1520ml温度不超过45熔化的培养基，混匀，凝固，倒置培养。若使用直径较大的平皿，培养基的用量应相应增加。,涂布法 方法 取1520ml温度不超过45的培养基，注入直径90mm的无菌平皿，凝固，制成平板，采用适宜的方法使培养基表面干燥。 接种量 不少于0.1ml。 适用
9、范围 适宜好氧菌培养。 注操作较繁琐，增加污染几率，计数不准确(涂布器会沾少许微生物) 。 一次只可加0.10.2ml样品。,薄膜过滤法滤膜的选择孔径应不大于0.45m,直径一般为50mm,若采用其他直径的滤膜,冲洗量应进行相应的调整。滤膜材质应保证供试品及其溶剂不影响微生物的充分被截留。,微生物计数方法,滤器注意点 滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。 使用时,应保证滤膜在过滤前后的完整性。 水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。 油类供试品,其滤膜和滤器在使用前应充分干燥。 为发挥滤膜的最大过滤效率,应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。 供试液经薄膜过滤后,若需要用
10、冲洗液冲洗滤膜,每张滤膜每次冲洗量为100ml。总冲洗量不得超过1000ml,以避免滤膜上的微生物受损伤。,微生物计数方法,新增内容 (MPN法) 原理：因为细菌在样本中是随机分布的，每个接种管内进入细菌的概率接近于泊松分布。所以检测细菌时，可按照概率理论计数置信度为95%时对应的菌落浓度区间以及置信区间内各菌落浓度的发生概率。 局限性：MPN法是一种采用数学理论推算，用置信区间描述菌落浓度的间接计数方法。 实验结果以MPN值表示，但MPN值不能表示实际菌落数，实际菌落数在置信区间内的任何一点。,新增内容(MPN法) 其结果是不可信的。 MPN法的精密度和准确度不及薄膜过滤法和平皿计数法. 用
11、于微生物计数时精确度较差，尤其是用于霉菌计数，存在结果误判的可能, 本法不适用于霉菌计数。 MPN法更适于微生物污染量较小的供试品。 MPN法仅在供试品需氧菌总数没有适宜计数方法的情况下使用。,微生物计数稀释液,微生物计数适用性试验,供试品的微生物计数方法适用性试验目的确认所采用的方法是否适合于该产品的微生物计数。重新进行适用性试验 若检验程序或产品发生变化可能影响检 验结果时，计数方法应重新进行适用性试验。 修订前 计数方法验证 修订后 计数方法适用性试验,试验菌株,计数方法适用性试验试验菌株,适用性试验用菌株接种和稀释,根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试 液。 为确认
12、供试品中的微生物能被充分检出，首先应选择最低稀释级的供试液进行计数方法适用性试验。 所加菌液的体积应不超过供试液体积的1%。 每1mL供试液或每张滤膜所滤过的供试液中含菌量不大于100cfu。,计数方法适用性试验,供试品检查阴性对照,计数方法适用性试验,若因供试品抗菌活性或溶解性较差导致所采用的方法不能通过 方法适用性试验，应采用适宜的方法对供试液进一步的处理。 如果抑制作用仍无法消除，可经过中和、稀释或薄膜过滤处理 后再进行方法适应性试验。,删除内容,计数方法适用性试验常见的中和剂或灭活方法,适用性试验 MPN,依据计数法要求制备供试液。 将试验菌分别接种供试液中，每 ml含菌量不大于100
13、cfu。 按10倍稀释法稀释3个稀释度,每个稀释度3管，共9管,3035 培养，大于3天。 菌液对照组 用稀释液替换供试液按以上方法进行操作。用平皿计数法确定加入试验组及菌液组的菌数，接种量应不大于100cfu。 读取试验组和菌液对照组的MPN值，判断试验组的MPN值是否在菌液对照组95%置信区间内，如果是，则方法适用性试验通过，否则需要重新进行优化。,计数方法适用性试验,若因供试品抗菌活性或溶解性较差的原因导致所采用的 计数方法不能通过方法适用性试验时，应采用适宜的方 法对供试液进行进一步的处理。,计数方法适用性试验,抗菌活性的去除或灭活 如果供试品对微生物生长的抑制作用无法以其他方式消除，
14、 可经以下方法处理后再进行试验。 增加稀释液或培养基体积. 加入适宜的中和剂或灭活剂。 采用薄膜过滤法。 上述几种方法的联合使用。,计数方法适用性试验,抗菌活性的去除或灭活 若使用中和剂或灭活剂，试验中应设中和剂或灭活剂对照组。 中和剂或灭活剂对照组：取相应量稀释液（浓度同供试液中的中和剂或 灭活剂浓度）替代供试液,同试验组操作，以确认其有效性和对微生物 无毒性。 消除抗菌剂的抑菌活性 可用中和剂或灭活剂，最好在稀释剂或培 养基灭菌前加入。 中和剂或灭活剂对照组的菌落数与菌液对照组的菌落数的比值应在 0.52范围内。,计数方法适用性试验,结果处理方法适用性试验符合要求，应以该稀释级供试液作为最
15、低稀释级的供试液进行供试品检测。若没有适宜的方法消除供试品的抑菌活性，那么方法适用性试验中微生物回收的失败可看成是因为供试品的抗菌活性引起的，同时表明该供试品不能被微生物污染。供试品也可能仅对试验用菌株具有抑制作用，而对其他菌株没有抑制作用。,计数方法适用性试验,结果处理根据供试品须符合的微生物限度标准和菌数报告规则，在不影响检验结果判断的前提下;采用能使微生物生长的更高稀释级的供试液进行方法适用性试验。若采用上述方法还存在一株或多株试验菌的回收达不到要求,那么选择回收最接近要求的方法和试验条件进行供试品的检查。,计数方法适用性试验,微生物的回收 计数方法适用性试验用的各试验菌应逐一进行微生物回收试验 。 方法 1.平皿计数法:倾注法 、涂布法 2.薄膜过滤法 3.MPN法培养条件细菌：培养温度3035，培养时间不超过3天；真菌：培养温度2025，培养时间不超过5天。,计数方法适用性试验,微生物的回收 注意点 一、倾注法 1、若使用直径较大的平皿，培养基的用量应相应增加。 2、每株试验菌每种培养基至少制备2个平皿，以算术均值作为计数结果 二、涂布法 1、 采用适宜的方法使培养基表面干燥。 2、 每一平皿表面接种供试液不少于0.1ml。3、每株试验菌与每种培养基至少制备2个平皿，以算术均值作为计数结果。,
