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1、Chapter 2 植物原生质体的分离、培养及融合,1. 原生质体的概念 植物细胞与动物细胞相比具有一层细胞壁，当将细胞壁除去后就可以得到裸露的球形细胞，称之为原生质体。,原生质体(protoplast)：指除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围的裸露细胞。 亚原生质体(subprotoplast)：在原生质体分离过程中，有时会引起细胞内含物的断裂而形成一些较小的原生质体就叫做亚原生质体。它可以具有细胞核或没有细胞核。 核质体(nuclearplast)：由原生质膜和薄层细胞质包围细胞核形成的小原生质体。也称为微小原生质体(miniprotoplast)。 胞质体（cytoplast）：不含细
2、胞核而仅含有部分细胞质的原生质体。,易混淆的概念,2. 原生质体具有以下特征： （1）无细胞壁障碍，可以方便地进行有 关遗传操作，并可以对膜、细胞器等进 行基础研究； （2）原生质体适合进行诱导融合形成杂 种细胞； （3）具有全能性，能进行人工培养出完 整植株。,原生质体培养是将植物的体细胞（二倍体细胞）经过纤维素酶等处理后去掉细胞壁，获得的原生质体在无菌培养基上生长、分裂，最终长成植株。原生质体培养植物 最有意义的应用在哪里？通常这种方法可将不同植物的原生质体融合后获得体细胞杂交的植株。,Section 1原生质体的制备,原生质体研究进展,植物原生质体培养研究中几个值得提出重要成就：1880
3、年，Hanstein首次起用原生质体(protoplast)一词。 1960年，Cocking首次应用酶法制备番茄根原生质体获得成功。 1971年，Takebe et al.首次得到烟草叶肉原生质体培养的再生植株。 1985年，Fujimura et al.第一例禾谷类作物水稻原生质体培养再生植株。 1986年，Spangenberg et al.单个原生质体培养再生植株在甘蓝型油菜上获得成功。,用于分离原生质体的材料准备 一、原生质体的来源 leaves seedlings (roots, hypocotyls, cotyledons) stems tissue cultures polle
4、n tetrads,二、原生质体的分离方法 1. 机械法 1892年，Klercker就采用机械方法从藻类中分离到原生质体。 方法：先使细胞质壁分离，再用刀把细胞壁切破，使原生质体流出或释放出来。这种方法手工操作难度大，以致于原生质体得率非常低，而且费时费力。 由于一直没有找到合适的获得原生质体的方法，所以很长一段时间没能成功进行原生质体大量培养。,2. 酶解法Because plant cell walls are omposed of cellulose, hemicellulose and pectin, the enzymes that degrade these polymers a
5、re used to prepare protoplasts., 1960 年， 英国诺丁汉大学的科金 （E.C.Cocking）第一次采用酶解的方法从番茄幼苗根尖中成功地大量制备出原生 质体，从而开创了酶法大量获得原生质体的新方法。 优点：条件温和、原生质体完整性好、活力高、得率高 等。,（1）原生质体分离常用的商品酶及来源 纤维素酶类onozuka R10 （绿色木霉）Cellulysin （绿色木霉）Driselase （Irpex lutens） 果胶酶 类Macerozyme R-10 （根霉）Pectinase（ 黑曲霉）Pectolyase Y-23 （黑曲霉） 半纤维素酶Rho
6、zyme HP-150 （黑曲霉）Hemicellulase （黑曲霉）,（2）渗透压细胞壁对细胞有良好的保护作用，除去细胞壁后，如果酶液中和细胞内的渗透压不平衡，原生质体会失水或吸水，应使其处于一个等渗的环境中。 渗透压调节剂： 蔗糖、甘露醇、山梨醇等,（3）酶解处理尽可能低的酶浓度和尽可能短的酶解时间 酶浓度：子叶、叶片等需酶量较少，愈伤组织、悬浮细胞需酶量大 酶解时间： 几小时十几小时 酶解温度：24 28,方法： Usually several hours to overnight incubations of plant tissues in an enzyme mixture ar
7、e used to produce protoplasts.,三、原生质体的收集和纯化 先将酶解混合物过滤（筛网孔径：40-100m），根据所用渗透压稳定剂（如：蔗糖、甘露醇）和植物材料的不同，采用不同方法进一步纯化。,1. 飘浮法 适用于：选择蔗糖为渗透压调节剂 方法：将滤液于1000rpm离心10min，原生质体将漂浮于溶液表面，吸出原生质体，用悬浮剂重新悬浮，常用的飘浮剂有蔗糖、Percoll、Ficoll，再离心，重复3次，最后用原生质体培养液洗涤一次，培养。 优点：原生质体纯度高、完整 缺点：数量较少,2. 沉淀法 适用于：甘露醇作为渗透压调节剂 方法：将滤液低速离心，使原生质沉于管
8、底，一般500-800rpm，35min 。 吸取上清，用洗涤液Percoll重悬后离心，重复三次，培养。 优点：操作简单，丢失少 缺点：离心等过程中因挤压和振荡易造成原生质体的损伤,3. 梯度离心法利用比重不同的溶液，离心后使原生质体处于两液相交界面，而杂质沉于管底。,四、原生质体活力检测 1. 目测法在显微镜下观察，根据细胞形态、流动性确定原生质体活力。 2. FDA（fluorescein diacetate, 二乙酸荧光素）法FDA是一种非极性物质，能自由地穿越细胞质膜，在活细胞内，FDA被酯酶裂解即发荧光（荧光素），由于荧光素不能自由通过质膜，因而可以在荧光显微镜下通过具荧光的细胞的
9、观察确定细胞活性。,3. 酚藏花红染色法有活力无色，无活力红色 4. 荧光增白剂染色法结合细胞壁绿色荧光，叶绿素红色 5. 伊凡蓝法伊凡蓝不能穿过质膜，只有质膜受到严重损坏时，细胞才能被染色，因而可以通过细胞被染色与否确定活性。,五、影响原生质体活力的因素 原生质体活力？ 有活力的原生质体数占所观察原生质体总数的比例1. 分离材料的生理状态 2. 酶解条件：酶质量、浓度、酶解温度、酶解时间、酶溶液的渗透压,3. 分离条件：离心次数、离心速度、纯化方法、分离持续时间 4. 环境条件：操作环境的温度、光照、分离用具的影响,果胶酶和纤维素酶对叶肉原生质体分离的影响,酶液渗透压对叶片原生质体的产量和活
10、力的影响,Section 2原生质体培养,一、培养基原生质体培养的培养基多来源于所用植物的组织培养基 1无机盐大量元素浓度浓度降低Ca 2+浓度维持较高的Ca 2+浓度NO 3和NH 4+的比例 培养早期降低NH 4+的比例,2渗透压 （1）常用的渗透压调节剂： 甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等 （2）原生质体的渗透压原则： 培养基渗透压与细胞渗透压等渗 3有机成分 原生质体培养需要大量有机成分：维生素、氨基酸、糖及糖醇，酵母提取物、水解酪蛋白等。,4激素 常用的激素：NAA、IAA、BA与2,4-D其比例和使用浓度需根据不同的培养阶段加以调整。5pH值一般在pH5.55.9,二、原生质体培养类
11、型 P78 液体浅层培养 3cm培养皿1-1.5ml，6cm2-3ml 固体培养 琼脂或琼脂糖浓度0.6 液体固体双层培养 琼脂糖珠培养,三、影响原生质体培养的主要因素 1. 基因型genotype举例： 较早的试验曾证明矮牵牛叶肉原生质体的不同生长发育时期是受不同基因所控制的。,Koornneef M et al.(1987)通过番茄与秘鲁番茄有性杂交后对性状分离的遗传分析，证明其愈伤组织的再生能力是两个显性基因所决定的。Cheng和Veilleux(1991)对芙薯(S. Phureja)原生质体的培养能力也做过遗传分析，并证明从原生质体培养到形成愈伤组织是受两个独立位点的显性基因所控制。
12、,Dudits等（1991）用苜宿(Medicago sativa)不同基因型做了较深入的研究，认为有某个基因型在离体培养时难以形成细胞胚。但是，如果将对激素调节有作用的发根农杆菌的rolB和rolC基因引入并表达，就可能促使其体细胞胚形成。,2.原生质体的来源供体材料类型 单子叶植物较双子叶植物的原生质体更难培养 供体细胞的分化程度 供体细胞的生长同步性,3. 起始培养密度与培养基基本起始密度初始植板密度一般104-105/ml 培养基激素水平 培养基营养成分完全性,密度对原生质体培养的影响,原生质体活力的重要指标植板率(plating efficiency, PE): 指用平板培养单细胞或
13、原生质体时长成细胞团的细胞占接种细胞总数的百分率,三种不同培养方法对木槿原生质体培养效果的影响,四、原生质体的发育和植株再生细胞壁再生细胞分裂愈伤组织或胚状体的形成器官分化愈伤组织先诱导芽的生成，诱导根胚状体可直接诱发 5. 植株形成,现在，我们来看几个原生质体培养的例子,分离茎外植体,酶消化获得原生质体,新鲜制的原生质体,第一次分裂,原生质体培养中得到的微小愈伤组织,微愈伤组织,植株再生,从原生质体再生的植株,来源于高粱叶肉原生质体愈伤组织的植物再生,A 新鲜分离的基因型296B叶肉原生质体 B 原生质体细胞分裂,C 培养15天后正在分裂的原生质体 D 培养20天后正在分裂的原生质体,E 培
14、养4周后形成的微细胞团 F 在KM8 培养基培养48天后形成的微愈伤组织,G 由原生质体形成的愈伤组织长出新芽 H 芽转移到温室的土壤中植株再生,原生质体培养实例：龙胆根原生质体的植株再生,材料准备preparative of material原生质体从细胞悬液中制得，所选细胞是在MS培养基中培养的一年生胚性愈伤组织。MS培养基中还添加有： A) 0.5mg/l 2,4-D + 1.0 mg/l kinetin B) 1.0 mg/l dicamba麦草畏 + 0.5 BAP + 0.1 mg/l NAA + 80.0 mg/l AS.,原生质体的分离protoplast isolation
15、：原生质体的分离和制备时采用酶法，每克细胞加入10ML的酶混合物加以酶解。酶解液配方为：Cellulase RS 1.5%, Hemicellulase 0.25%, Pectolyase Y23 0.04%, Driselase(崩溃酶担子菌) 0.5%, Macerozyme(离析酶根酶) R10 1.5% .,A) 新鲜制得的原生质体 B) 24小时候细胞壁再生 C) 10天后开始最初的细胞分裂,原生质体培养 protoplast culture 1、可以采用三种不同类型的培养方式: 液体培养薄层琼脂培养 琼脂糖珠培养 2、渗透压的优化调节可以通过不同浓度的甘露醇来调节：3%, 6% a
16、nd 9%。此外，11和13甘露醇经测试可用于原生质体体细胞胚发生。原生质体植板密度2 x 105/ml。,原生质体培养用培养基,DICAMBA：麦草畏（2-甲氧基-3,6-二氯基苯甲酸）,D) 不同培养基上的原生质体培养 E) KM DIC培养基上生长出球形胚胎,原生质体继续培养在再生培养基上: after 10 days B) after 4 weeks C) after 6 weeks,五、原生质体培养中的一些生理问题1逆境反应 细胞壁降解酶是一种逆境诱导剂，可以产生活化氧自由基引起脂类过氧化，减少细胞流度同时伴随着细胞膜的渗漏，且造成蛋白质和脱氧核糖核酸的破坏。细胞的逆境反应一般是快速地产生涉及诱发不同代谢途径（例如苯基丙烷途径phenyl-propanoid route）的酶系统，结果形成了植物抗毒素(phyto-alexins)和如木质素一类的结构多聚物。 有些逆境反应对原生质体制备和培养是不利的，例如在甜菜原生质体制备时由于某些酶的活性增强使得形成类脂过氧化物(lipid peroxides)，结果引起原生质膜的氧化损伤。而对马铃薯原生质体活力的损伤乃是由于乙烯产生所致。,
