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1、大肠杆菌,大肠杆菌的历史,肠杆菌科,为革兰氏阴性杆菌。根据生化反应、血清学试验、DNA同源性研究，肠杆菌科至少包括28个菌属，110个以上的菌种。 埃希菌属（Escherichia）中最重要的是大肠埃希菌(E. coli) ，常称为大肠杆菌。 大肠杆菌广泛分布于自然界，包括腐生菌、寄生菌和人及动物的病原菌。多数是人和动物肠道正常菌群的重要成员。 20世纪中叶，认识到一些特殊血清型的大肠杆菌对人和动物有病原性，尤其对婴儿和幼畜（禽），常引起严重腹泻和败血症。,一 、大肠杆菌的一般特性,1、G直短杆菌，两端钝圆，散在或成对。,革兰染色,2、周身鞭毛，能运动，无芽孢 ，有的有荚膜。 3、代谢能力强，
2、代谢类型是异养兼性厌氧型 。,二 、培养及生化特性,1、培养特性 兼性厌氧； 最适生长温度37，最适生长pH7.27.6； 普通琼脂培养基：生长良好，圆形凸起、光滑、湿润、半透明、灰白色菌落，直径约23mm； 普通肉汤培养基：均匀浑浊，管底有粘性沉淀，液面管壁有菌环。, 肠道菌鉴别培养基 麦康凯琼脂培养基：红色菌落。 伊红美兰琼脂培养基：黑色带金属闪光的菌落。 SS琼脂培养基：一般不生长或生长较差，生长者呈红色。 血平板：一些致病性菌株常溶血。,麦康凯琼脂培养基,伊红美兰琼脂培养基,SS琼脂培养基,血平板,2、 生化特性,I：吲哚试验 M：甲基红试验 V：V-P试验 C：枸橼酸盐利用实验,（1
3、）三糖铁培养基 配方 牛肉膏 5g 硫酸亚铁 0.2g 氯化钠 5g 蒸馏水 1000mL 蛋白胨 20g 硫代硫酸钠 0.2g 蛋白胨 5g 琼脂 1 2g 乳糖 10g 2%酚红溶液 12.5ml 蔗糖 10g 葡萄糖 1g,原理 测定细菌对葡萄糖、乳糖及蔗糖的发酵反应，以及能否产生硫化氢。可鉴别肠道菌。,葡萄糖 乳糖 蔗糖 硫酸亚铁,大肠杆菌,沙门菌,能产硫化氢菌株,发酵葡萄糖和乳糖；大量产酸产气,底层和斜面均呈黄色，底层有气泡,只发酵葡萄糖产酸产气,底层黄色，斜面保持红色,因形成硫化亚铁而使培养基呈黑色,对照,假单胞菌,志贺氏菌,沙门氏菌,大肠杆菌,变形杆菌,三糖铁培养基,吲哚试验,V
4、-P试验,枸橼酸盐试验,甲基红试验,IMViC试验,三、大肠杆菌的基本结构,(一)细胞壁 大肠杆菌的细胞壁分外膜和肽聚糖层。 外膜是大肠杆菌细胞壁的主要成分，主要由磷脂、蛋白质和脂多糖组成。 脂多糖是革兰氏阴性细菌的内毒素，也是革兰氏阴性细菌细胞壁的特有成分，主要与抗原性、致病性及对噬菌体的敏感性有关。,外膜,周质,细胞质膜,（二）质粒 F因子：又称致育因子，插入、复制和转移的功能。有F因子的大肠杆菌为雄性，用F+表示，不含F因子的大肠杆菌称为雌性，用F-表示。通过F+和F-细菌的接合，F因子可经性菌毛传递给F-菌株，使F-菌株转变为F+菌株。 R因子 ：抗性转移因子和抗性决定因子 。 Col
5、因子：产大肠杆菌素因子，编码合成大肠杆菌素 。,四、大肠杆菌的特殊结构,1、荚膜 荚膜具有抗原性，构成了大肠杆菌的表面抗原，即K抗原 。 2、鞭毛 由鞭毛蛋白组成，构成了细菌的鞭毛抗原，与运动有关。 3、菌毛 在细胞表面还含有一种比鞭毛更细更短更硬的丝状体叫菌毛，可分为普通菌毛和性菌毛。,大肠杆菌可以透过接合作用传递遗传物质。,五、抗原及血清型,（一）抗原 O抗原，即菌体抗原，为细胞壁脂多糖。该抗原刺激机体主要产生IgM类抗体。 H抗原， 即鞭毛抗原 ，H抗原主要刺激机体产生IgG类抗体，与其他肠道菌基本无交叉反应。 K抗原，即荚膜抗原，位于O抗原外层，为多糖。具有K抗原的菌株不能被其相应的抗
6、O血清所凝集叫“O不凝集性”。 据耐热性不同，K抗原又分为：L、A和B 三型。,L型K抗原：对热敏感，100 1h破坏其抗原性，并失去与相应抗体的结合力和凝集性，位于被膜中，偶见于荚膜中。 A型K抗原：耐100 1h ，但121 2.5h破坏其抗原性和O不凝集性，但保留与相应抗体结合能力。位于荚膜中，抗A血清可使具有相应A抗原的菌体出现荚膜肿胀现象。 B型K抗原：100 1h 破坏其抗原性与相应抗体的凝集性，但保留其与相应抗体结合力。,（二）血清型 可用O:K:H排列表示其血清型。如：O8:K23:H19，表示该菌具有O抗原8，K抗原23，H抗原为19。 致人畜腹泻的产肠毒素大肠杆菌，除含K抗
7、原外，还可含有蛋白质性粘附素抗原。对粘附素抗原应并列写于多糖K抗原之后。如：O8:K87，K88:H19 中 K88即为粘附素抗原。,六、致病性,（一）致病物质 1、定居因子（Colonization factor ，CF）；也称粘附素，即大肠杆菌的菌毛。 2、肠毒素是肠产毒性大肠杆菌在生长繁殖过程中释放的外毒素，分为耐热和不耐热两种。 耐热（ST）：10020min不破坏，免疫原性弱。 不耐热（LT）：65 30min破坏，免疫原性强。 3其他：细胞壁脂多糖的类脂A具有毒性；K抗原有抗吞噬作用，有抵抗抗体和补体的作用 。,（二）所致疾病 1肠道外感染：多为内源性感染，以泌尿系感染为主；大肠杆
8、菌可侵入血液，引起败血症；大肠杆菌性脑膜炎 。 2急性腹泻 （1）肠产毒性大肠杆菌（ETEC） （2）产志贺毒素大肠杆菌(STEC） （3）肠致病性大肠杆菌（EPEC） （4）肠出血性大肠杆菌（EHEC） （5）肠侵袭性大肠杆菌（EIEC ） （6）肠粘附性大肠杆菌（EAEC）,肠产毒性大肠杆菌（ETEC）,ETEC是致人和幼畜腹泻最常见的病原菌；毒力因子有粘附素性菌毛和肠毒素。,致病过程,七、抵抗力,大肠杆菌对热的抵抗力较其他肠道杆菌强。 55加热60min或60加热15min仍有部分细菌存活。 胆盐、煌绿等对非致病性大肠杆菌有选择性抑制作用，而对致病性大肠杆菌无抑制作用，所以用肠道选择鉴别
9、培养基来分离致病性大肠杆菌。 对磺胺类、链霉素、氯霉素等敏感。,八、非致病性大肠杆菌的作用,保护肠道的微生态平衡。消耗肠道内的氧气，创造厌氧环境，利于厌氧菌的生长；分解代谢产物供厌氧菌生长。 能合成维生素K和B。 对外袭菌有拮抗作用。某些大肠杆菌能产生大肠菌素，对一些病原微生物具有拮抗作用。,九、微生物学的诊断,1、病料的采集：肠道外感染取中段尿、血液、脓液、脑脊液等，腹泻者取粪便。 2、分离培养：粪便标本直接接种肠道杆菌选择性培养基。其他病料可同时接种血琼脂平板和肠道杆菌选择性培养基。37培养1824h后，观察菌落并涂片染色镜检。 3、生化鉴定：大部分菌株发酵乳糖产酸产气，并发酵葡萄糖、乳糖
10、、麦芽糖、甘露醇和木胶糖等产酸产气。 IMViC试验为“+ + - -”。即为典型大肠杆菌。,病料,腹泻或水肿病例,败血症病例,常采集粪便或肠粘膜刮取物,常采集血液及其病变组织,麦康凯或伊红美兰琼脂平板划线,血琼脂或麦康凯琼脂平板划线,挑取疑似大肠杆菌菌落510个分别在琼脂平板进行纯培养,革兰染色镜检,接种TSI琼脂培养基,革兰氏染色阴性,生化试验,血清学鉴定,猪水肿病菌株,猪腹泻菌株,Stx2e检测,肠毒素检测,临床上只检测O抗原,4、血清型鉴定,假定试验：取经生化试验证实的大肠杆菌培养物，用致病性大肠杆菌，侵袭性大肠杆菌和产毒素大肠杆菌多价O血清和出血性大肠杆菌的O157血清做玻片凝集试验
11、。 当与某一种多价O血清凝集时，在与该多价O血清的单价O血清做实验。如与某一单价O血清发生强凝集反应，则为假定试验阳性。 证实试验：制备O抗原悬液。原效价为1：1601：320的O血清，用0.5%盐水稀释至1：40。稀释血清与抗原悬液在10mm75mm试管内等量混合，做试管凝集试验。混匀后放于50水浴箱内，经16h后观察结果。如出现凝集，可证实为该O抗原。,假定试验,大肠杆菌培养物,致病性大肠杆菌 多价O血清,侵袭性大肠杆菌 多价O血清,产毒素大肠杆菌 多价O血清,出血性大肠杆菌 O157血清,玻片凝集试验,证实试验,O抗原悬液,O血清,试管内等量混匀,50水浴箱，16h,结果判定,试管凝集试
12、验,5、Stx2e的检测 （1）Vero细胞毒性试验； （2）小鼠神经毒性试验； （3）抗Stx2e抗体中和试验； （4）PCR方法对Stx2e基因特异序列的扩增。 6、ETEC肠毒素检测 （1）检测LT的常用方法:兔回肠结扎肠试验；ELISA；中国地鼠卵巢细胞培养法；平板免疫溶血试验； （2）检测ST常用方法有：乳鼠胃内投服试验；GM1-ELISA等。,十、卫生细菌学检查 1、细菌总数：检测每毫升或每克样品中所含细菌数，采用倾注培养计算。 2、大肠菌数检验：指100g1000mL水中所含大肠菌群的最近似数（MPN），采用乳糖胆盐发酵试验检测。,乳糖胆盐发酵试验,发酵试验,分离培养,复发酵试验,食品执行标准：含乳蛋白冷冻饮品菌落总数应小于25000cfu/ml，大肠菌群小于450MPN/100ml； 含豆类冷冻饮品菌落总数应小于20000cfu/ml，大肠菌群小于450MPN/100ml；含淀粉或果类冷冻饮品菌落总数应小于3000cfu/ml，大肠菌群小于100MPN/100ml；食用冰块菌落总数应小于100cfu/ml，大肠菌群小于6MPN/100ml。,
