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1、l毕毕 业业 论论 文文题题 目目 ：西伯利亚蝗基因组西伯利亚蝗基因组 DNADNA 不同不同提取方法的研究提取方法的研究姓姓 名名 ： 专专 业业 ： 生物技术生物技术班班 级级 ： 院院 （系）：（系）： 生命与环境科学学院生物系生命与环境科学学院生物系指导老师指导老师 ：新新 疆疆 师师 范范 大大 学学l目目 录录 中文摘要 3英文摘要 4引言 51 材料与方法 61.1 实验材料 61.2 主要试剂 61.3 主要仪器 61.4 研究方法 71.4.1 SDS-蛋白酶 K 消化法 71.4.2 饱和 NaCl 法 81.4.3 CTAB 法 91.5 电泳及结果记录 102 结果与分
2、析 102.1 总 DNA 的提取结果 102.2 结果与分析 123 讨论 133.1 三种不同 DNA 提取方法的比较 133.2 实验结果不理想的原因分析 14参考文献 15l西伯利亚蝗基因组西伯利亚蝗基因组 DNADNA 不同提取方法的研究不同提取方法的研究（新疆师范大学生命与环境科学学院 乌鲁木齐 830054）摘要：摘要：本实验以新疆草原蝗虫的主要危害种类西伯利亚蝗为研究对象，分别对干制和乙醇浸泡的标本用 SDS 法、饱和 NaCl 法和 CTAB 法进行了基因组 DNA 的提取比较。实验结果表明，SDS 法提取的总 DNA 带型整齐，饱和 NaCl 法和 CTAB 法提取的标本总
3、DNA 获得率较低，在琼脂糖凝胶电泳检测中大部分有明显降解。另外，乙醇浸制的标本总DNA 的获得率及质量均高于干标本。研究结果可为今后进一步开展蝗科亲缘关系分析、基因组比较和遗传多态性等分子生物学研究提供基础资料。关键词：关键词：基因组DNA , 不同方法, 西伯利亚蝗Studies on different extraction methods of Gomphocerus sibiricus genomic DNA（College of Life and environment sciences ,Xinjiang Normal university, urumqi 830054）Abst
4、ract: The experiments in Xinjiang grassland locusts main types of hazards Gomphocerus sibiricus for research, genome DNA of grasshoppers which were kept as dry sample or preserved in 100% ethanol was extracted using SDS method，Saturated NaCl law and the law CTAB extraction of DNA genome comparison.E
5、xperimental results showed ,SDS method brought from the total DNA, saturated Nacl law and the law CTAB extraction of total DNA in specimens of the lower rate in most Agarose gel electrophoresis testing marked degradation. In addition, ethanol college system overall DNA specimens obtained were higher
6、 than the rate and quality of the dry specimens. The results will further their relatives for Acrididae future analysis, genome comparison and genetic polymorphism, and other molecular biology research based information.Key words: genomic DNA extraction, different extraction methods , Gomphocerus si
7、biricusl引言引言蝗虫是农、牧、林业的主要害虫之一，有些种类甚至可造成毁灭性的灾害。因此，对蝗虫开展各方面研究都有很重要的意义1。为有效防治蝗虫灾害,必须正确识别蝗虫种类。有关蝗虫的分类研究已有很多报道2,前人已采集了大量的标本,命名了大量的模式种,这些模式种构成了蝗虫系统分类的基础和框架,用分子生物学技术研究蝗虫分类和系统演化时,若能用到这些标本和模式种,可以极大地扩展蝗虫分类和系统演化的分子生物学研究范围,有助于建立正确和完善的分类体系,构建系统的发育树35, 而提取高质量和高产量的基因组 DNADNA 是进行各种 PCRPCR、SouthernSouthern 杂交、构建 cDNA
8、cDNA 文库及其它一些分子生物学研究的基础和前提6。在实际工作中, 由于很难直接用活标本进行实验,常常使用的是干制标本或浸泡标本。而若标本保存不当,细胞内DNADNA 发生降解,则难以获得高质量的DNADNA模板,导致PCRPCR 扩增结果不稳定甚至无扩增产物出现,给实验工作者带来诸多不便7。因此，为开展蝗虫分子系统学研究，需要通过试验寻找一种快速、简便、高质量抽提蝗总DNA的方法。基因组DNA的应用十分广泛，提取方法在国内外亦有不少报道811，概括起来可分为两大类：（1）盐析提取法；（2）有机溶剂提取法12。本文分别用SDS-蛋白酶K消化法、饱和NaCl法、CTAB法三种不同的提取方法，综
9、合其他各种昆虫基因组DNA提取方法的优点，对新疆草原的主要危害种类西伯利亚蝗（Gomphocerus lsibiricus）干制标本和无水乙醇保存的标本进行了基因组DNADNA的提取方法的比较，为进一步开展蝗虫分类学研究提供基础资料。1 1 材料与方法材料与方法1.11.1 实验材料实验材料本实验所用蝗虫标本见表 1。表 1 研究样本来源及保存方式Table 1 Research sources and the preservation of samples 种名 采集地点 采集时间 保存方式西伯利亚蝗 新疆哈密 2005 年 6 月 干标本西伯利亚蝗 新疆哈密 2005 年 6 月 无水乙醇
10、固定1.21.2 主要试剂：主要试剂：(1)(1) 提取试剂：Tris（三羟甲基氨基甲烷）、EDTA（乙二氨四乙酸） 、SDS（十二烷基硫酸钠）、蛋白酶 K、酚、氯仿、异戊醇、 无水乙醇、异丙醇、RNA 酶、-巯基乙醇、CTAB（十六烷基 三甲基溴化铵）等。(2)(2) 电泳试剂：琼脂糖、TBETBE、溴酚兰、蔗糖等。1.1. 3 3 主要仪器：主要仪器：台式冷冻高速离心机 D-37520 德国电子天平 AL-204 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司座式自动蒸汽灭菌锅 ZDX-35SBI 上海申安医疗器械厂热空气消毒箱 GRX-9203A 上海一恒科技有限公司电热恒温水浴锅 DZKW-S-8
11、 北京光明医疗器械厂超净工作台 SW-CJ-IF 苏州安泰空气技术有限公司冰箱 BCD-208K/ACJN 青岛海尔股份有限公司l电泳仪 DYY-2C 北京六一仪器厂紫外分析仪 WD-9403B 北京六一仪器厂凝胶成像仪、移液枪等。1 1.4 4 研究方法：研究方法： 1.4.1 SDS-蛋白酶蛋白酶 K 消化法消化法1214 (1)试剂及溶液试剂及溶液A 液：Tris 0.05 mol/L、NaCl 0.1 mol/L、EDTA 0.1 mol/LpH 7.08.0。B 液：5%的 SDSC 液：2 mg/mL 的蛋白酶 K（2）操作方法：）操作方法：1）取样：将蝗虫干标本和无水乙醇浸制标本
12、用无菌三蒸水冲洗23 次;用无菌三蒸水浸泡 48 h 以上,弃水；弃去浸泡液,取蝗虫后足股节肌肉,剪碎材料于装有 0.8 mL 匀浆液（A 液）的 1.5 mL Eppendorf 管中。2）研磨: 与离心管相匹配的玻璃棒将样品研磨至匀浆状。3）加入 0.1 mL 的 5SDS 和 0.1 mL 的 2 mg/mL 蛋白酶 K。4）水浴：37水浴 13 h，直至混合液消化得很清亮为止。5）酚抽提：在混合液中加入等体积的平衡酚，上下缓慢颠倒十次，切勿剧烈振荡，在台式高速离心机上 6 000 r/min 离心 10 min,取上清液。6）重复步骤 5：直至水相与酚相的界面处看不到白色的蛋白质层为l
13、止，取上清液。7）氯仿异戊醇(241)抽提:上清液中加入等体积的氯仿异戊醇，上下缓慢颠倒十次，在台式高速离心机上 8 000 r/min 离心 10 min,取上清液；再次重复此步骤。8）沉淀 DNA：在上清液中加入 2体积的冷无水乙醇(预先置-20冰箱内)沉淀 DNA冰箱内放置 10 min，12 000 r/min 离心 10 min, 弃上清液。9）洗涤 DNA：在留有沉淀的离心管中加入 1 mL70%的冷乙醇洗涤DNA，在台式高速离心机上 10 000 r/min 离心 5 min,倾去上清液。10）保存：自然干燥，加适量 TE 或无菌三蒸水溶解，于- 20保存备用。1.4.2 饱和饱和 NaCl 法法9 ,15 （1）试剂及溶液）试剂及溶液 浸泡液（TE）：10mmol/Ltris-HCl、200mmol/LEDTA、50mmol/L NaCl pH8.0。消化液：STE（0.1mol/L Nacl、10 mol/L Tris-HCl、1mmol/LEDTA pH 8.0、1 % SDS、200g/ml Proteinase K。蛋白酶 K：2 mg/mL 饱和 NaCl 溶液、异丙醇、70%的乙醇。（2）操作方法：）操作方法：1)乙醇固定标本用无菌三蒸水浸泡 48 h 以上,弃水;对干标本,用浸泡l液（TE）浸泡 48 h 以上，弃去浸泡液 TE,取蝗虫后足股节肌肉
