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1、Western Blot觉得割胶用电话卡很容易割破，然后剪膜目测真的好难，膜的蛋白面不好判断不知道有没有好的方法？配胶：先配分离胶，再配浓缩胶。（物品大部分在新冰箱4 度，用完最好尽快拧紧放回）我们实验室常配的（单位均为 ml）分离胶10ml 分 离 胶15ml 浓缩胶2ml浓缩胶4ml超纯水20 30 14 27 30Acr/Bic（丙烯酰胺）40 60 033 067 1.5 mol/L TrisHCl（pH8.8）38 57 1 mol/L TrisHCl（pH6.8）025 05 10SDS 01 015 002 004 10%APS （过硫胺酸）01 015 002 004 TEME
2、D 0004 0006 0002 0004 注意： TEMED量很少，所以要注意观察有没有吸上来，也要注意不能插太深，防止枪头壁上粘太多步骤：.样品制备1培养细胞或药物处理。2弃培养基，用1X PBS 漂洗细胞2 次，去尽残留培养基。3加入 1X SDS 样品缓冲液 (6-well plate(6 孔板 ), 100 l /w或 75 cm2 plate, 500-1000 l/瓶)，刮落细胞，转移到 Ep 管。 注意： 冰上操作。4超声1015 秒剪切 DNA 以减低样品粘性。5煮沸样品5 minutes。6离心12000g, 5 min ，取上清。（可省）7电泳分离：上样15 l20 l
3、至 SDS-PAGE 胶 ( 10 cm x 10 cm) 电泳。如要定量检测某蛋白的表达水平，应用 RIPA 裂解液 (1 ml per 107 cells/ 100 mm dish （培养皿）/ 150 cm2 flask)裂解细胞，收集裂解液至离心管中，在振荡器上混匀415min， 14000g 离心 15min（ 4），弃沉淀，用 Bradford 法或其它蛋白质测定方法测定上清中蛋白浓度以调整上样体积和上样量，进行Western 杂交时还需设置内或外参照，通常用beta-actin。注意： 一般上样2030 g 已足够，如待检蛋白为低丰度蛋白，可加大上样量至100g ，但电泳条带易拖
4、尾，可制备亚细胞组份或采用更敏感的检测方法。（1） 清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，用洗洁精将板洗净。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。（2） 配胶与上样：先配分离胶，再配浓缩胶。1、 玻璃板对齐后放入制胶架中卡紧（一定要对齐，以免漏胶）。然后垂直卡在夹子上准备配胶。2、 按前面方法配分离胶，加入 TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时， 用枪吸取1ml 胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带下缘以下5mm 高度时即可，给积层胶留出足够空间（梳齿长再加1cm） 。然后胶上加一层无水酒精 ，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板
5、流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要慢，否则胶会被冲变型。）3、 当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝固（30min ） 。再等3min 使胶充分凝固就可倒去胶上的酒精，并用滤纸将酒精吸干。4、 按前面的方法配5的浓缩胶 ,加入 TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将 梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平（梳子使用前保证干净且干燥）。待到浓缩胶凝固后（室温30min ） ，将凝胶放入电泳槽中，小玻璃板面朝内（若只跑一块胶，则槽的另一边要垫一块塑料板，且有字的一面朝内） 。在上下槽内加入电泳液，上槽内的电泳液应没过小玻璃
6、板上缘，下槽内的电泳液应没过金属丝，排除凝胶底部两块玻璃板之间的气泡。加入电泳液后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。5、 用电泳液冲洗一下浓缩胶，（目的是去除梳子遗留下的未凝固的丙烯酰胺，以免造成条带变形）可以前一天配胶备用，保鲜膜4 度保存，可一周。6、制备样品：测完蛋白浓度后，计算含2050g 蛋白（根据自己的实验需要进行选择，没有固定的量，一般为40 50ug。 ）的样品体积即为上样量。取出上样样品至200l 的 EP管中，加入5SDS上样缓冲液至终浓度为1（上样缓冲液与样品蛋白体积之比为1:4） 。 （上样体积一般在10 l 与 20l 之间） （其实大一点的垂直电泳槽每孔
7、最大上样量可以达到40 l，胶做得很好的话，50l 问题也不大） 上样前要将样品100加热 5-15min 使蛋白变性，立即冰浴，然后低速离心5min。 （可以使用PCR仪进行变性（ 95,10min） ）应根据上样缓冲液浓度的不同，制备样品。样品分装成小管，储于-80。蛋白质在非变性条件下的电泳分离是由其分子量大小与电荷共同决定的，在变性条件下与SDS结合后，其电泳分离只由分子量大小决定。7、 加足够的电泳液后准备上样。上样之前一定要把上样孔冲洗干净，冲走未凝固的丙烯酰胺。用移液枪将样品吸出，注意不要吸进气泡。将枪头插至上样孔中加入样品（上样速度要快，防止样品扩散导致相互影响，但上样过快又会
8、使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时要换枪头，以免交叉污染）。一般marker（Fermentas 的 0671 或 0441）加 6ul。为避免边缘效应，最好选择中间的孔上样。8、 电泳：将电泳槽与电泳仪相接，红接红，黑接黑。跑浓缩胶时用80V，到分离胶后用120V。溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜（一般让目的条带跑过分离胶的1/3 比较好。当然，不要局限于此说明） 。电泳时间也取决于要检测的蛋白分子量的大小。9、 转膜（1）从负极（黑板）到正极（透明板）方向依次：纤维垫、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、纤维垫，呈三明治样。在加有转膜液的盘里放入转膜用的夹子、两块纤维
9、垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜。（甲醇浸泡）（2） 将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张纤维垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。 （一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。）在垫子上垫三层滤纸（可三张纸先叠在一起再垫于垫子上），一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。（3） 将小玻璃板撬掉，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬（撬时一定要小心，胶很易裂，要用巧劲） 。除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作），要避免把分离胶刮破。小心剥下分离胶，根据需要横向切胶，并根据胶的大小裁剪同样大小PVDF膜，剪去膜的右上角作为标记（当剪去的角在右上方时有蛋白面朝上，在右下方时有蛋白面
10、朝下）。如果样本多， 同时做几张膜， 可用铅笔在膜下角标ABCD或 1234，这样可以分出膜的正反和加样顺序。注意：裁滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。将裁好的PVDF膜置于甲醇中浸一下才可使用。在膜上盖3 层滤纸并除去气泡。最后盖上另一个纤维垫，擀几下就可合起夹子。整个操作在转膜液中进行，要不断的擀去气泡。（转移液含甲醇，操作时要戴手套，实验室要开门以使空气流通）（最后做成的“三明治”千万不能形成短路，不然有可能会短路烧坏转膜装置）。（4） 将夹子放入转膜槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。转膜时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。液面应该没过夹子上缘，在电泳槽周围
11、放置碎冰，打开电源， 280mA ，1.5h。（我们实验室没那么久，一般43Min ）（1.应根据蛋白分子量的大小确定转膜时间，对于小分子量的蛋白，转膜时最好垫两块PVDF膜，以免转膜过头，因为如果第一张膜上蛋白质已经转过了，第二张膜上还有蛋白质可以进行检测；对于分子量大的蛋白，转膜时间要长一点，开始最好也用两块膜，特别是务必注意加强降温措施。当然转膜是要摸条件的，最好刚开始做的时候摸个转膜的时间梯度。如果由于时间原因来不及做下面实验，可以在4 度下 12V 转膜过夜）（2.PVDF膜建议使用0.22的小孔径膜，不容易转膜过头）（3.不同的转膜装置，转移效率是不一样的，所以换用转膜装置，最好再
12、摸个条件）（4.转膜时电极方向注意是膜正胶负）10、 考马斯亮蓝染胶（一般不需要做这步）转完后将膜用1丽春红染液染5min（于脱色摇床上摇） 。然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。将膜晾干备用。11、封闭：洗膜： TBST洗膜一次。 10min 封闭： 5%脱脂奶粉配制：TBST 40ml +脱脂奶粉2g。将 NC膜（蛋白面朝下）移入盛有封闭液的塑料盒中，室温摇床孵育1h。12、洗膜： TBST洗膜一次。 10min 13、抗体孵育：孵育一抗：用5%脱脂奶粉 -TBST按适当比例 (一般是1000:1)稀释一抗（ 1ml 5%脱脂奶粉： 1mlTBST加 0.05g 奶粉） 。在塑料
13、盒中加入一抗，加在膜上。摇床摇半小时后，继续下面实验或放在湿盒中4过夜。洗膜： TBST ，室温下摇床上35 次 5-10min 。孵育二抗：用5%脱脂奶粉 -TBST按适当比例（一般小鼠5000:1，兔 2000:1）稀释二抗。在塑料盒中加入一抗，加在膜上。室温摇床孵育1h2h。洗膜： TBST ，摇床上洗35 次 5-10min。14、曝光：（曝光的整个过程需要避光，准备好所有仪器）1）吸取两种发光液各200ml 于 EP管中，吹打混匀2）膜放在培养皿中加发光液于膜上，置于黑暗中3Min 。依次准备曝光液。3）膜放入两层保鲜膜中（之前可稍微在滤纸上吸干），保鲜膜在曝光夹内。4）放上胶片，合
14、上曝光夹5）3-5Min 后用镊子拿出胶片开红灯，把胶片放入显影液内，不时观察有无黑色的条带出来。到显影完全，转入水中洗净，转入定影液，这个不需要多久的，然后转入水中。回收显影液定影液，胶片晾干。注意事项：1.最常见的问题是背景信号过高。处理：进一步稀释一抗；使用含有去污剂的封闭缓冲液；使用其他封闭试剂，如牛血清白蛋白；减少蛋白上样量2.所有步骤均要使用去离子水。3.手上的油脂会影响蛋白的转移，操作时应戴手套。4.某些抗体会由于去污剂的存在而不与蛋白结合。 附录参考 1配胶：一般两者同时配制，只是最后分离胶先加TEMED 混合后立即灌胶，而积层胶放4， 等分离胶凝固后再加 TEMED混匀后灌胶
15、。（为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED 量加大，一般加至原来的 2-3 倍，根据实验当时的温度适当调整）2ml 5%积层胶3ml 5%积层胶5ml 8% 分离胶5ml10% 分离胶10% 两 块胶5ml15%分离胶超纯水1.4 2.1 2.3 1.9 2.85 1.1 30Acr/Bic0.33 0.495 1.3 1.7 2.55 2.5 1.5 mol/L TrisHCl（pH8.8）1.3 1.3 0.95 1.3 1 mol/L TrisHCl（pH6.8）0.25 0.375 10SDS 0.02 0.03 0.05 0.05 0.075 0.05 10%APS （过硫胺酸）
16、, 现配现用0.02 0.03 0.05 0.05 0.075 0.05 TEMED 0.002 0.003 0.003 0.002 0.003 0.002 2双丙烯酰胺：丙烯酰胺摩尔比1：29 配制时， SDS-PAGE 有效分离范围按所需分离的蛋白质分子大小选择合适的丙烯酰胺百分比浓度，一般地，5%的凝胶可用于60200kDa 的SDS变性蛋白质分子的分离，10%用于 1670kDa，15%用于 1245kDa。附录配液：1.10% SDS溶液 (m/v)：SDS 0.1g DDH2O1ml 加热溶解，室温保存，用后马上拧紧瓶盖。2.10% 过硫酸铵 :APS APS 0.1g DDH2O 1ml 由于过硫胺酸会缓慢分解，最好新鲜配制，或隔周配制（也可每200 微升 EP分装， 4保存 4W，-20保存 1 月）3.1 电泳缓冲液Tris base 3.028g Glycine 14.4g SDS 1.0g
