药物制剂的微生物学检测

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1、药物制剂的微生物学检查,第一节 中药制剂的无菌检查,灭菌制剂与无菌制剂的概念 灭菌制剂：系指采用某一物理、化学方法杀灭或除去所有活的微生物繁殖体和芽胞的一类药物制剂。 无菌制剂：系指采用某一无菌操作方法或技术制备的不含任何活的微生物繁殖体和芽胞的一类药物制剂。 无菌制剂包括：注射用制剂，眼用制剂；植入型制剂；创面用制剂；手术用制剂等直接注射于体内或直接用于创面、黏膜等的一类制剂。 这些制剂必须保证不含活的微生物，否则注入人体将会引起严重的事故。因此，在出厂、上市前都必须按药典规定的方法进无菌检查。,一、无菌检验的基本原则,1.严格进行无菌操作 无菌检查应在环境洁净度10 000级下的局部洁净度

2、100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程必须严格遵守无菌操作，防止徽生物污染。 2.建立方法的验证 进行药品的无菌检查法时，应进行方法的验证，以证明所采用的方法适合于该药品的无菌检查。若药品的组分或原检验条件发生改变时，检查方法应重新验证。 3.相关试剂及培养条件 供试品检查时，使用的表面活性剂、中和剂或灭活剂，应证明其有效性及对微生物的生长和存活无影响。将供试品分别接种于适合需氧菌、厌氧菌、霉菌生长的培养基中，在适宜条件下培养，细菌培养温度为3037；霉菌、酵母菌培养温度为2328。,4.正确采集样品 无菌检验是对整体中部分样品进行随机抽检，来推断整体是否有菌的情况(无菌或染菌)

3、。因此，在一批药品的无菌检验中，取样数量愈少，染菌的检出率愈小；取样愈多，染菌的检出率愈大，该批药品通过无菌检验的几率愈小。无菌检验时取样量和比例必须严格按规定执行。 5.检查结果判断 需氧菌、厌氧菌及霉菌检查中任何一不符合者，则判供试品不合格。,二、无菌检查的基本方法,（一）一般注射剂的无菌检查 1.一般注射剂指本身不含有任何抗菌或抑菌成分，剂型为 水溶性药品的无菌检查。 2.包含需氧菌、厌氧菌和真菌三类微生物的检查。 3.方法：直接接种法 4.将供试品按量分别直接接种于适宜需氧菌、厌氧菌和真 菌生长繁殖的一定量培养基中。,直接接种法图示,无抗菌作用的供试品,抽样,接种于培养基硫乙醇酸盐培养

4、基及改良马丁培养基管,培养,细菌 37 霉菌、酵母菌 25,接种,第二节 药物的微生物限度检查,药物的微生物限度检查，是指非规定灭菌制剂（如口服药及外用药物）及其原、辅料受到微生物污染程度的一种检查方法。 检验项目主要有：细菌总数、霉菌总数和控制菌检测。,药典化学药制剂通则项下的微生物限度要求,无菌检查：注射剂、植入剂、冲洗剂。 无菌检查及微生物限度检查：软膏剂、眼用制剂、气雾剂、喷雾剂、散剂、耳用制剂、鼻用制剂、凝胶剂、 乳膏剂。 微生物限度检查：粉雾剂、口服溶液剂、口服混悬剂 、口服乳剂、搽剂、洗剂、局部用片剂、酊剂、栓剂、糖浆剂、膜剂、贴剂、灌肠剂、糊剂、涂剂、涂膜剂 。 原则性要求：丸

5、剂、口服片剂、胶囊剂、颗粒剂。,药典中药制剂通则项下的微生物限度要求,无菌检查：注射剂。 无菌检查及微生物限度检查：散剂、软膏剂、眼用制剂、 鼻用制剂、气雾剂*、喷雾剂。 微生物限度检查：丸剂、颗粒剂、片剂、锭剂、煎膏 剂、胶剂、糖浆剂、合剂、滴丸剂、胶囊剂、酒剂、 酊剂、流浸膏剂、浸膏剂、露剂、茶剂、栓剂、贴膏 剂(贴剂)、凝胶剂、搽剂、洗剂、涂膜剂. 不要求：膏药。,二、口服及外用中药的微生物学检查,口服制剂：细菌总数、霉菌总数、大肠杆菌和活螨的检测 外用药物：绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、破伤风梭菌 一般眼科制剂：细菌总数、霉菌总数、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌 以上药物均不能检出致病菌！,实验

6、方法,（一）、蜜丸细菌总数测定 （二）、蜜丸霉菌总数测定 1、无菌条件下随机称取10g蜜丸置研钵中逐渐加入100ml生理盐水研磨为1：10药液，分别量取9ml生理盐水置10ml 具塞刻度试管中，其中一支加入1：10药液1ml后稀释为1：100后再取1ml加入9ml生理盐水具塞刻度试管中药物稀释为1：1000。,2、取10个干烤后玻璃平皿，其中6个平皿，每2个分别加入1：10，1：100，1：1000药液各1ml，然后加入50普通琼脂培养基、（2，3，5-氯化三苯基四氮唑）15ml做细菌培养；剩余的4个平皿，每2个分别加入1：10，1：100，药液各1ml共4个，然后加入50虎红马丁培养基15m

7、l做霉菌培养，并立刻转动平板使药液与培养基充分混匀。10个平板置37培养箱培养24h后并计数每个稀释度的3个平板的菌落均数。,3、选取菌落平均值在30-300之间的平板作为菌落总数的测定范围，将数得的菌落数乘以相应的稀释度得到每克检测蜜丸中细菌总数。选取霉菌菌落平均值在5-50之间的平板作为霉菌总数的测定范围，将数得的菌落数乘以相应的稀释度得到每克检测蜜丸中霉菌总数。,当仅有1个稀释级的菌落数符合上述规定，以该级的平均菌落数稀释倍数报告菌数。 当同时有2个稀释级的菌落数符合上述规定时，视两者比值而定。 若比值2, 以两稀释级的菌落数乘以稀释倍数的均值报告菌落数； 若比值2但5时，以低稀释级的菌

8、落数乘以稀释倍数的值报告菌落数； 当出现比值5，或高稀释级的菌落数低稀释级的菌落数等异常情况时，应查明原因再行检查，必要时，应进行方法的重新验证。,高稀释级的菌落数稀释倍数,低稀释级的菌落数稀释倍数,比值,菌落数报告规则,当各稀释级的平均菌落数均30个，以最低稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。 若各稀释级的平均菌落数均300个，以最高稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。 若各稀释级的平均菌落数均不在30300个之间，一个稀释度大于300个，相邻另一个稀释度小于30个，则以接近30300个的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。 如各稀释级的平板均无菌落生长，或测定数在10个以下

9、时，报告菌数为10个。,被检药物细菌、霉菌总数应在药典规定的限量以内，否则为不合格。如中药浓缩丸、中成药片剂及西药片剂细菌数每克不得超过1000个；中药蜜丸、小丸每克不得超过10000个。中药蜜丸、水丸霉菌数每克不得超过500个；中药浓缩丸霉菌数每克不得超过100个。,（二）致病菌检测,阳性对照试验： 供试品进行控制菌检查时，应做阳性对照试验。阳性对照试验的加菌量为10100 CFU，方法同供试品的控制菌检查。阳性对照试验应检出相应的控制菌。 阴性对照试验： 取稀释液10ml照相应控制菌检查法检查，作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。,1大肠埃希菌的检查 大肠埃希菌是人和动物肠道中寄生的正常菌

10、群，随粪便排出体外，可直接或间接污染药物及药品生产的各个环节。服用后有可能被粪便中存在的肠道致病菌或寄生虫卵等病原体感染。因此，大肠埃希菌被列为粪便污染指示菌，是口服药品常规必检项目。,（二）致病菌检测,大肠埃希菌检查程序 供试品（1:10稀释） 供试液10ml 不少于100ml的乳糖胆盐增菌液 37 1824h 取增菌液划线转种 伊红美兰琼脂平板（或麦康凯琼脂平板） ,阴性 菌落紫黑色、有金属光泽,乳糖发酵、IMViC试验,发酵乳糖产酸产气、 MViC：+ + - -,（1）增菌 目的:抑制不需要的细菌生长，而有利于需检菌的生长。培养基:乳糖胆盐 (BL)培养基，作用:胆盐(或去氧胆酸钠)具

11、有抑制革兰阳性细菌生长的作用。 方法：按该品种验证的方法将供试液10ml接种至100ml的乳糖胆盐培养基中， 37培养1824h，必要时可延至48h。,（2）分离培养： 伊红美蓝琼脂(EMB)或麦康凯琼脂（MacC）平板 将上述培养液划线接种于伊红美蓝琼脂平板或麦康凯琼脂平板，37培养1824h。若平板上无菌落生长、或生长的菌落与下表所列的菌落形态特征不符，判供试品未检出大肠埃希菌。,大肠埃希菌菌落形态特征,划线接种于伊红美蓝琼脂平板,大肠埃希菌在麦康凯琼脂平板上 发酵乳糖菌落,大肠埃希菌在伊红美蓝琼脂平板上的菌落特征,（3）纯培养、染色、镜检，观察染色性及形态 （4）生化反应 主要是与产气杆

12、菌进行鉴别，大肠埃希菌与产气杆菌两者在形态、染色性、菌落等方面十分相似。因此，须通过生化反应来鉴别。挑取可疑菌落做乳糖发酵试验和IMViC试验吲哚试验（I）、甲基红试验(M)、V-P试验(Vi)和枸椽酸盐利用试验(C)试验。 结果：大肠埃希菌为+ + - - 产气杆菌则为- - + + （5）结果报告 完全符合以下结果：革兰氏阴性无芽孢杆菌；乳糖发酵产酸产气；IMViC试验反应为+-。应判定为检出大肠埃希菌。,吲哚试验（I）+ -,甲基红试验(M) + -,VP试验（Vi）+ -,枸椽酸盐利用试验（C） + -,I-吲哚（indol）试验 色氨酸吲哚玫瑰吲哚 吲哚试剂,- +,M - 甲基红（

13、methyl red）实验 葡萄糖丙酮酸乙酰甲基甲醇 甲基红 - 葡萄糖丙酮酸 甲基红 +,- +,V - VP（Voges-Proskauer）试验,葡萄糖丙酮酸乙酰甲基甲醇 二乙酰红色化合物 + 胍基化合物 葡萄糖丙酮酸 乙酰甲基甲醇 -,- +,C -枸橼酸盐利用（citrate utilization）试验,利用枸橼酸盐生长 + 不能利用 -,- +,第三节 药物的抗菌试验,药物的抗菌试验目的是为了检查药物的抗菌能力，包括药物的抑菌试验和杀菌试验。 一般先进行体外抗菌试验，再进行体内抗菌试验。该项试验方法 已广泛应用于新药研究和指导临床用药。,(一)体外抑菌试验,1.连续稀释法 用于测

14、定药物的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC), MIC是指药物能抑制细菌生长的最高稀释度，以g/ml或U/ml表示，数值愈小，药物的抑菌作用愈强。 （1）液体培养基稀释法： 在试管中用液体培养基进行2倍系列稀释药物 在每管中加等量的试验菌液 1624h培养观察结果，以能抑制试验菌生长的最低浓度（最高药物稀释度）为该药的MIC。,液体培养基稀释法药敏试验的抗生素溶液稀释方案,判断抑菌还是杀菌，应将未长菌的试管内培养液再移种于琼脂平板上，如重新长出试验菌，表明该浓度只是抑菌浓度。药物的抑菌或杀菌作用是在一定条件下相对而言的，这与用药时培养基的组成

15、、pH及所用的菌种、菌量等因素有关，所以必须严格控制试验菌、培养基等试验条件。,液体培养基稀释法测定药物的最小抑菌浓度(MIC),液体培养基稀释法测定最小抑菌浓度（MIC）通过平板培养证实,最小杀菌浓度（minimal bactericidal concentration，MBC）,按液体培养基稀释法操作测出药物的MIC，将未长菌的各管培养液分别移种到无菌平板上，培养后以无细菌生长的最低药物浓度（最高药物稀释度）作为该药物的MBC。,（2）固体培养基稀释法： 1）平板法： 方法：将不同浓度的药液按19混入尚未凝固的琼脂培养基中 制作成含有递减浓度药物的琼脂平板将定量的菌液点种法逐个点种于平板 37培养24h 测得各种细菌对药物的MIC。 应用：测定多种细菌对同一药物的MIC； 各种药物的抗菌活性测定； 新抗菌药物的筛选。 优点：不受药物颜色及浑浊度的影响，且手续简便。 2）斜面法： 方法：将不同递减浓度的药液混入未凝固的装有琼脂培养基的试管中制成斜面接种定量的试验菌液培养测知MIC （g/ml）。 应用：适用于必须较长时间培养的试验菌(如结核杆菌)或避免孢子飞扬污染环境的霉菌。,