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1、溶血性贫血的 实验室检查,Laboratory diagnosis of hemolytic anemia,本章提纲,一、溶血性贫血定义和分类二、溶血性贫血的确诊试验三、溶血性贫血原因的实验室检查,贫血外周血中单位容积内红细胞计数、血红蛋白含量或红细胞比容（Hct）低于正常下限。,症状: 疲乏困倦； 气促；心悸；食欲差，腹帐、便秘； 头晕、眼花，嗜睡，精力不集中,体征： 皮肤黏膜苍白； 黄疸； 肝脾肿大,贫 血,失血性贫血 缺铁性贫血 巨幼细胞性贫血 再生障碍性贫血 溶血性贫血,溶血性贫血：各种原因使红细胞生存时间缩短，破坏增多，骨髓造血代偿不足时发生的一类贫血,红细胞破坏增加,红细胞代偿性增
2、加,溶血：红细胞非自然衰老而提前遭受破坏的过程。 溶血性疾病：发生溶血而骨髓能够代偿，未出现贫血。 溶血性贫血：溶血程度超过造血代偿能力，出现贫血。,定义,溶血性贫血的分类根据红细胞破坏的场所：,血管内溶血：在血流中被破坏获得性因素和酶缺陷血管外溶血：在单核-巨噬系统中被破坏膜缺陷、珠蛋白异常、脾功亢进原位溶血： 在骨髓中被破坏巨幼细胞贫血、急性白血病,溶血性贫血的分类根据发生机制：,代表疾病,膜,酶,血红蛋白,红细胞 内在缺陷,遗传性球形红细胞增多症 遗传性椭圆形红细胞增多症,G6PD缺陷症 PK缺陷症,珠蛋白生成障碍性贫血 异常血红蛋白病,溶血性贫血的分类,红细胞外在因素损伤,免疫因素,非
3、免疫因素,AIHA,CAS,PCH,药物诱发的免疫性溶贫,新生儿同种免疫性溶贫,溶血性输血反应,PNH,微血管病性溶血性贫血,心源性溶血性贫血,行军性血红蛋白尿症,砷化物、硝基苯、苯肼、蛇毒等中毒,溶血性链球菌、疟原虫、产气荚膜杆菌等感染,（一）显示红细胞破坏增加的依据1 红细胞寿命缩短、破坏增加的检验红细胞寿命测定； 红细胞形态改变； 血浆LDH测定,2 血红蛋白代谢的检验血浆游离血红蛋白测定(40mg/L)；血管内溶血的指征血清结合珠蛋白测定 (500-1500mg/L)；肝脏合成的2糖蛋白，运输游离血红蛋白血浆高铁血红素白蛋白试验；不敏感，见于严重血管内溶血,（二）显示红细胞代偿增生依据
4、外周血网织红增多；外周血红细胞形态：大小不均，大红细胞、嗜多色细胞及有核红细胞，Howell-Jolly小体、Cabot环、点彩红细胞等增生性贫血骨髓象：增生明显活跃，红系显著增生，粒系相对减少，巨核系一般正常,（二）显示红细胞代偿增生依据外周血红细胞形态：大小不均，大红细胞、嗜多色细胞及有核红细胞，Howell-Jolly小体、Cabot环、点彩红细胞等,Howell-Jolly小体 Cabot环,特 点,1.遗传性溶血性贫血常有贫血、黄疸、脾肿大的家族史 2.某些溶贫呈一定的地域性分布 3.化学因素所致常和患者所从事的职业有关 4.多种药物都可致溶贫 5.长期反复贫血和黄疸见于遗传性溶贫，
5、自身免疫性溶血性贫血亦常表现为时重时轻 6.恶性淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病和SLE易并发AIHA，人工心脏瓣膜置换术后常易致继发性红细胞破碎综合征,溶贫的实验室诊断,1.确定是否为溶血性贫血 2.确定主要的溶血部位是血管内还是血管外 3.查找溶血原因，明确诊断,Hb代谢示意图,珠蛋白 血红素 铁 +卟啉,单核巨噬系统 脾脏,血管外溶血,RBC,血管内溶血,血浆游离Hb,肾脏,血红蛋白尿,游离胆红素,肝脏,结合珠蛋白,近曲小管上皮细胞,肾阈,结合胆红素,粪胆原的肠肝循环,含铁血黄素尿Rous 实验,胆汁,粪胆原,肠道,血液,肾脏,尿胆原,高铁血红蛋白,清蛋白/血红素蛋白,检 查一溶血性贫血的筛查
6、检测血浆游离血红蛋白测定参考值 0-40 mg/L意义：见于血管內溶血血清结合珠蛋白检测参考值 0.5-1.5g/L意义：见于血管內溶血及严重的血管外溶血,血浆高铁血红素清蛋白检测正常结果：阴性意义：阳性见于严重血管內溶血 含铁血黄素尿试验（Rous 试验）血红蛋白在肾小管上皮细胞代谢为含铁血黄素，脱落后铁染色法查出正常结果：阴性意义：阳性见于慢性血管内溶血 红细胞寿命测定正常红细胞半衰期为天溶血性贫血時常天,溶血原因分析的有关检验,一、红细胞膜缺陷的检验二、红细胞内酶缺陷的检验三、珠蛋白合成异常的检验四、自身免疫性溶血的检验五、阵发性睡眠性血红蛋白尿症有关检测,一、红细胞膜缺陷的检测,（一）
7、红细胞渗透脆性试验（erythrocyte osmotic fragility test) 目的：了解红细胞的渗透脆性（即抵抗力）原理：,红细胞皱缩,红细胞膨胀甚至破裂,高渗溶液,等渗溶液,正常,红细胞对低渗溶液的抵抗能力0.6 - 0.8%NaCl溶液红细胞不破裂0.42-0.45%NaCl溶液部分红细胞破裂0.35-0.30%NaCl溶液红细胞完全破裂,NaCl,0.6%,对低渗溶液抵抗能力减小即RBC渗透脆性增加,脆性增高：遗传球（椭）、AIHA伴球形细胞增多（在0.52或0.72开始溶)。 脆性减低: 各型地中海贫血、缺铁性贫血、肝硬化及阻塞性黄疸等。,结果： 正常人开始溶血0.40.
8、4%，完全溶血0.280.32% （患者与对照相差0.04%以上即为阳性）。,（二）红细胞孵育渗透脆性试验 （erythrocyte incubated osmotic fragility test) 原理：红细胞在37 C孵育过程中，葡萄糖消耗增加，ATP贮备减少，钠泵受阻，钠离子在胞内聚集，红细胞膨胀破裂参考值：未孵育 50%溶血 4.00 - 4.45 g/L NaCl溶液37 C孵育50%溶血 4.65 -5.90 g/L NaCl溶液临床意义：用于轻型遗传性球形细胞增多症、遗传性非球形细胞溶贫的诊断和鉴别诊断,（三）自身溶血试验（及纠正试验）（autohemolysis and co
9、rrection test),原理：先天性非球形细胞溶血性贫血病人红细胞内酶缺陷，葡萄糖酵解障碍，生成ATP不足，不能维持钠泵，导致溶血增强。加入葡萄糖或ATP，观察溶血能否被纠正。,参考值：正常人红细胞孵育48h小时后，溶血度3.5%；加入葡萄糖或ATP后明显纠正，溶血度1%,I型：G6PD缺乏症； II 型：丙酮酸激酶缺陷症,自身溶血试验及纠正试验结果（溶血%）,二、红细胞酶缺陷的检测,葡萄糖6磷酸脱氢酶缺乏症蚕豆病：患者多为儿童，在每年3-5月蚕豆成熟季节发病。起病急，在食新鲜蚕豆几小时至几天突然发作。表现为急性溶血伴有血红蛋白尿，治疗以输血、防治急性肾功能衰竭及肾上腺皮质激素为主。,(
10、一) 高铁血红蛋白还原试验,正常时亚铁Hb 经亚硝酸盐氧化成高铁Hb，当红细胞内G6-PD含量正常时，Hb Fe+ 可以还原为Fe+(红色)；G6-PD缺乏时， Hb Fe+ 则不能还原为Fe+(褐色)，通过颜色变化来间接测知G6-PD含量是否缺乏。,目的：该试验用来了解G-6PD活性，是一种间接的方法。,红细胞对Glu的代谢有2个途径,1、无氧糖酵解(90%),2、戊糖旁路途径(5-10%),原理：,G6PD,高铁Hb还原酶,G6P,G6-PA,NADP,NADPH,还原型美兰,氧化型美兰,高铁Hb（Fe3+）为褐色,氧合HB（Fe2+）红色,结果：光电比色法 ，正常还原率75%，低于75%
11、为异常， 提示G6PD活力，74 31%为G-6PD缺乏的杂合子（红棕 色），30%以下为显著缺陷的纯合子（为棕色 目测比色法）。,（二）氰化物-抗坏血酸盐试验 原理:6-磷酸葡萄糖 NADP GSH H202 氧合血红蛋白6-磷酸葡萄糖酸 NADPH GSSG H20 高铁血红蛋白结果:正常人标本呈红色临床意义:1.纯合子G6PD缺乏经1-3h温育后,变为棕色2. 杂合子标本3-4h变成棕红色,G-6PD,（三）变性珠蛋白小体生成试验,又称“红细胞包涵体”、 “赫恩小体”、 “Heinz小体”、 “海因小体”原理：G-6PD缺乏及不稳定Hb病患者 Hb易被氧化，其珠蛋白变性沉着于红细胞膜上。
12、,抗凝血 +乙酰苯肼,37温育24h,充分的氧化,其Hb氧化成Heinz小体（用结晶紫、甲紫或煌焦油兰染色，油镜观察）,1. 正常人 30% 2. G6P缺陷症、不稳定Hb、HbH病等常高于45%,结果： 该小体为圆形或多角形色涵体，0.22um。 多位于红细胞边缘，一个红细胞含120个，多为12个，以含5个以上小体的红细胞计数,（四）G6PD荧光斑点试验和活性测定原理: G6PD 使NADP还原成NADPH, 后者在紫外线照射下发出荧光 参考值：正常人强荧光；酶活性 5 U/gHb,三、珠蛋白合成异常的检测,血红蛋白的结构原卟啉 血红素 Hb（四聚体） 铁 2条链珠蛋白：由4条多肽链组成2条
13、非链,正常人 HbA（22） 97% HbA2（22）1.5-3%HbF（2 2） 0.5-0.8%,血红蛋白病珠蛋白肽链量的不正常(地中海贫血) 血红蛋白分子结构异常(异常血红蛋白病) 遗传性溶血性疾病,(一) 血红蛋白电泳,蛋白质的两性性质是由氨基酸的NH+与COO- 决定的。 等电点调节水溶液的pH，能使蛋白质的NH+与COO- 数目相等呈电中性，此时蛋白质无电泳，在水中电解度小，并发生沉淀。,电泳：一个带电荷的离子或胶体颗粒在电场中可向一极移动。,原理：在一定的pH缓冲液中，缓冲液的pH大于Hb等电点，其带负电，在电场中向阳极移动；反之向阴极移动。 由于各种Hb珠蛋白肽链结构不同，其等
14、电点不同，电泳方向和速度亦不同，故可分离出不同的区带，对区带进行电泳扫描，可进行Hb定量分析。,(+) H J K A G D E (-) 1. HbH增多是HbH病，为-地中海贫血的一种；HbA2明显增高见于轻型地中海贫血；HbF 明显增高见于中重型地中海贫血。2. 正常值：醋纤法（PH8.6）HbA 96%98% ，HbA2 1.0%3.1% ， HbF2%,电 泳 结 果,CA,A2,F,A,异常,正常,（二） HbF （2 2）酸洗脱试验：含HbF红细胞着色 （三）HbF定量测定（碱变性试验）: 2岁-成人 HbF4%为异常，重型 地贫30-90%，遗传性胎儿血红蛋白持续存在综合症10
15、0% （四）HbA2定量测定诊断轻型地贫的重要依据 （五）限制性内切酶谱分析,四、自身免疫性溶血性贫血检验,自身免疫性溶血性贫血 （autoimmune hemolytic anemia,AIHA),1.病因：抗红细胞自身抗体的产生机制尚未阐明，有以下的解释：病毒感染可激活多克隆B细胞或化学物与红细胞膜相结合，改变其抗原性，导致自身抗体产生2.分类： 本病可为原发性的，也可继发于结缔组织病、造血系统肿瘤、感染等。按抗体反应最适温度分为温抗体型和冷抗体型，后者又分为冷凝集素综合征和阵发性冷性血红蛋白尿,（一） Coombs试验（抗人球蛋白试验）,原理：不完全抗体(IgG)，无法架接两个邻近的红细胞，而只能和一个红细胞抗原相结合。抗人球蛋白抗体是完全抗体,可与多个不完全抗体的Fc段相结合,导致红细胞凝集现象,称为抗人球蛋白试验阳性。,目的：检查红细胞表面的或血清中游离的不完全 抗体，用于诊断AIHA。,
