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1、目录前言1 蛋白质及三聚氰胺1 蛋白质1 三聚氰胺2 蛋白质含量检测技术2凯氏定氮法 2 紫外吸收法 3双缩脲法（ Biuret法） 3Folin酚试剂法（ Lowry 法） 4考马斯亮蓝法 （Bradford 法） 4BCA （Bicinchoninine acid assay）法 4各种蛋白质检测方法对比 5小结 7参考文献 7食物中蛋白含量检测- 1 - 前言事故一： 2008年中秋节，本应该是祥和的节日气氛却笼罩上了沉重的阴影：国内奶制品行业的巨头， 三鹿集团生产的部分三鹿牌婴幼儿奶粉，因含有人为添加的三聚氰胺， 导致部分食用该奶粉者出现泌尿系统结石病例。截至9月15日早8时，临床诊断
2、患儿已达 1253名(其中2名已死亡 )。事故二： 2007年3月起，中国江苏和山东两企业输往美国的宠物食品诱发大量猫狗死亡。 之后调查显示， 这两个企业部分出口的小麦蛋白粉和大米蛋白粉违规添加了三聚氰胺。 事发后，中国相关产品短期内的出口在多个国家遭禁，“中国制造”受到质疑。事故三：相信许多人对四年前发生在安徽阜阳的“大头娃娃”事件还记忆犹新：一百多名婴儿受害，十多名名婴儿死亡，震惊全国。原因是是40多种不知名的劣质奶粉， 以低价在当地农村长期销售，其营养成分， 尤其是蛋白质含量严重低下，结果造成婴儿发育迟缓和死亡事件。三次触目惊心的食品安全事故，起因都是不法厂商为了提高最终产品或原料中蛋白
3、质的含量而进行掺假所引起的。经惨痛教训后，检测技术迅速发展，以寻求简便、快速、准确、敏感性高的检测方法满足日趋严格的检测要求，保障人们饮用牛奶的卫生和安全。蛋白质及三聚氰胺蛋白质蛋白质是生物主要的组成部分，各种酶，细胞因子都属于蛋白质，蛋白质的重要性不言而喻。人体摄取蛋白质类营养，不光是数量，其种类、构成也是非常重要。蛋白质的营养价值主要取决于被人体消化吸收的程度和该种蛋白质所含氨基酸的种类及组合。 凡易于被人体消化、 吸收和利用的蛋白质， 其营养价值就高。从消化的角度来看，动物蛋白质比植物蛋白质更易消化和吸收。从蛋白质的氨基酸的组成种类上来看， 人体蛋白质由 20种氨基酸组成， 其中12种氨
4、基酸是人体可以通过自身生化反应合成的，被称为非必需氨基酸；还有8种氨基酸人体不能合成，必须从食物中摄取，被称为必需氨基酸。动物蛋白中，一般都含有人体必需的 8种氨基酸，特别是蛋制品和乳制品，故一般来说动物蛋白营养价值比植物蛋白高。正因为蛋白质有着如此重要的重要性及营养价值，蛋白质含量才成为食品检测中的重要指标。食物中蛋白含量检测- 2 - 三聚氰胺三聚氰胺，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，简称三胺，又叫2，4，6- 三氨基-1，3，5-三嗪。化学式C3N6H6或 C3N3(NH2)3，相对分子质量 126，其结构式如下：物理性质：三聚氰胺为白色晶体，无味，密度为1.573gcm3 (16)。常
5、压熔点354 （分解） ；快速加热升华，升华温度 300。溶于热水，微溶于冷水，可溶于甲醇、甲醛、乙酸、热乙二醇、甘油、吡啶等。化学性质：呈弱碱性（ pH8） ，与盐酸、硫酸、硝酸、乙酸、草酸等都能形成三聚氰胺盐。在中性或微碱性情况下，与甲醛缩合而成各种羟甲基三聚氰胺，但在微酸性中（pH 值5.56.5） 与羟甲基的衍生物进行缩聚反应而生成树脂产物。遇强酸或强碱水溶液水解， 胺基逐步被羟基取代， 先生成三聚氰酸二酰胺， 进一步水解生成三聚氰酸一酰胺， 最后生成三聚氰酸。 在一般情况下较稳定， 但在高温下可能会分解放出氰化物。主要用途：三聚氰胺是一种用途广泛的基本有机化工中间产品，最主要的用途是
6、作为生产三聚氰胺甲醛树脂（MF）的原料。三聚氰胺还可以作阻燃剂、减水剂、甲醛清洁剂等。三聚氰酸毒性危害及诊治：目前三聚氰胺被认为毒性轻微，大鼠口服的半数致死量大于 3克/公斤体重。据 1945年的一个实验报道：将大剂量的三聚氰胺饲喂给大鼠、兔和狗后没有观察到明显的中毒现象。动物长期摄入三聚氰胺会造成生殖、泌尿系统的损害，膀胱、肾部结石，并可进一步诱发膀胱癌。蛋白质含量检测技术凯氏定氮法：目前蛋白质含量检测的国标规定方法是凯氏定氮法。由于蛋白质是含氮的有机化合物，蛋白质平均含氮量约16% ，经典的凯氏定氮法检测的原理其实是检测食品中氮的总含量。其基本过程是将食品与硫酸和催化剂一同加热消化， 使蛋
7、白质分解， 分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离， 用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘食物中蛋白含量检测- 3 - 以换算系数， 即为蛋白质含量。 所以凯氏定氮法实际上测的不是蛋白质含量，而是通过测氮含量来推算蛋白质含量，显然，如果样品中还有其他化合物含有氮，这个方法就不准确了。 在通常情况下， 这不是个问题， 因为食物中的主要成分只有蛋白质含有氮，其他主要成分（碳水化合物、脂肪）都不含氮，因此凯氏定氮法是一种很准确的测定蛋白质含量的方法。但是如果有人往样品中偷加含氮的其他物质，就可以骗过凯氏定氮法，从而达到了人为提高蛋白质含量目的。显然，三聚氰胺这次是钻了
8、空子。其实凯氏定氮法的缺陷并不难弥补，只要多一道步骤即可：先用三氯乙酸处理样品。三氯乙酸能让蛋白质形成沉淀，过滤后，分别测定沉淀和滤液中的氮含量， 就可以知道蛋白质的真正含量和冒充蛋白质的氮含量。这是生物化学的常识，也早成为检测牛奶氮含量的国际标准（ISO 8968） 。目前常用的蛋白质定量方法除凯氏定氮法外还有有以下五种：紫外吸收法：蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下， 蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓
9、度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。优点：简便、灵敏、快速。对低浓度的盐，如 (NH4)2SO4等及和大多数缓冲液有一定的抗干扰能力。缺点：测定准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、 嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化，故测定样品时的要统一pH值。双缩脲法（ Biuret法） ：双缩脲（ NH3CONHCONH3）是两个分子脲经 180左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或
10、两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为110mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris 缓冲液和某些氨基酸等。食物中蛋白含量检测- 4 - 此法的优点是较快速， 不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。 因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。Folin 酚试剂法（ Lowry 法） ：以最早期的双缩脲法为基础，并有所改进。蛋白质与Cu2反应，产生蓝色的反应物。但是与双缩脲法相比， Lo
11、wry 法敏感性更高。 缺点是需要顺序加入几种不同的反应试剂；反应需要的时间较长；容易受到非蛋白物质的影响；含EDTA ，Triton x-100，(NH4)2SO4等物质的蛋白不适合此种方法。考马斯亮蓝法（ Bradford 法） ：这种方法的原理是蛋白质与考马斯亮兰结合反应，产生的有色化合物吸收峰595nm 。其最大的特点是，敏感度好，是Lowry 和 BCA 两种测试方法的 2 倍；操作更简单，速度更快；只需要一种反应试剂；化合物可以稳定1小时，方便结果；而且与一系列干扰Lowry，BCA 反应的还原剂（如DTT ，巯基乙醇）相容。但是对于去污剂依然是敏感的。缺点：使用不同蛋白质的标准品
12、会导致同一蛋白样品的定量结果差异较大。考马斯亮蓝法示意图BCA （Bicinchoninine acid assay）法：这是一种较新的、更敏感的蛋白测试法。要分析的蛋白在碱性溶液里与Cu2反应产生 Cu ，后者与 BCA 形成螯合物，形成紫色化合物，吸收峰在562nm波长。此化合物与蛋白浓度的线性关系极强，反应后形成的化合物非常稳定。相对于Lowry 法，操作简单，敏感度高。但是与Lowry 法相似的是容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。食物中蛋白含量检测- 5 - BCA法示意图各种蛋白质检测方法对比各种蛋白质测定方法比较如下：方法灵敏度时间原理干扰物质说明紫外吸收法50 100mg ，快
13、速510分钟蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收各种嘌吟和嘧啶；各种核苷酸测定准确度较差，干扰物质较多双缩脲法（Biuret法）120mg中速2030分钟多肽键碱性 Cu2紫色络合物铵盐；Tris缓冲液：某些氨基酸用于快速测定，但不太灵敏；不同蛋白质显色相似凯氏定氮法（Kjedahl 法）15mg ，费时810小时将蛋白氮转化为氨，用酸吸收后滴定各种铵盐用于标准蛋白质含量的准确测定；无法区别含氮化合物干扰；费时长Folin 酚试剂法, , （Lowry5mg慢速4060分钟双缩脲反应；磷钼酸磷钨酸试剂被 Tyr 和铵盐；Tris缓冲液；甘氨酸；各种耗费时间长；操作要严格计时；颜色
14、深浅随不同蛋白质变化; 标准曲线不食物中蛋白含量检测- 6 - 法）Phe还原硫醇是严格的直线形式，且专一性差考马斯亮蓝法(Bradford 法)15mg,快速515分钟考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，其 lmax 由465nm变为595nm强碱性缓冲液；TritonX-100;SDS较好的方法；干扰物质少；颜色稳定；颜色深浅随不同蛋白质变化 ; 标准曲线有轻微的非线性BCA法普通 BCA为20200mg,微量 BCA为0.5 10mg较快速40分钟内在碱性环境下蛋白质与Cu2+ 络合并将 Cu2+ 还原成 Cu1+螯合剂；略高浓度的还原剂抗干扰能力强，从以上各种蛋白质测定方法的比较， 我们不难
15、发现，考马斯亮蓝法（Bradford 法） ，BCA （Bicinchoninine acid assay）法由于其反应原理是反应物与蛋白质直接作用，对铵盐类等含氮化合物的抗干扰能力较强，可作为凯氏定氮法检测蛋白质含量时的补充验证手段。使用化工原料搀入食品以达到提高蛋白质含量的作假手段，很大程度上是针对某种特定的检测手段如凯氏定氮法。只要明确了一种分析手段， 就会找到相应的干扰物质用于提高蛋白质含量的检测值。因此，在复杂混合物蛋白质含量检测上，应该首先通过实验验证，确定几个可用的检测手段，在实际应用中，做到几个检测手段联合应用，相互参照，将大大提高蛋白质测定的准确性。食物中蛋白含量检测- 7 - 小结在食品中添加化工原料是一种性质非常恶劣的犯罪行径，我们姑且还是可以认为大多数有良知的商家是不会
