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1、基因信息的传递,基因：编码生物活性产物的DNA功能片段,基因三大特征：携带遗传信息能被复制能突变,复制,翻译,蛋白质 （病毒）,RNA （病毒）,逆转录,转录,RNA,翻译,蛋白质,DNA,复制,中心法则（The central dogma）,DNA的生物合成 (复制) DNA Biosynthesis，Replication,第 12 章,复制(replication) 指遗传物质的传代，以亲代DNA为模板，dNTP (dATP dGTP dCTP dTTP)为原料，按碱基配对规律合成子代DNA的过程。,复制的基本规律 Basic Rules of DNA Replication,第一节,一
2、、半保留复制(semi-conservative replication),子链继承母链遗传信息的几种可能方式,密度梯度实验,DNA半保留复制模型,按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。,半保留复制的意义,遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。,原核生物复制时，DNA从起始点(origin)向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉(replication fork) 。,二、双向复制 (bidirectional replication),A. 环状双链DNA及复制起始点 B. 复制中的两个复制叉 C. 复
3、制接近终止点(termination, ter),三、复制的半不连续性 (semi-discontinuous replication),领头链 (leading strand),随从链 (lagging strand),半不连续性复制过程中，领头链连续复制，而随从链不连续复制的现象。冈崎片段(okazaki fragment)不连续复制的片段,参与DNA复制的物质,模板(template) : 解开成单链的DNA母链 底物(substrate): dNTP DNA聚合酶(polymerase): 简写为 DNA-pol RNA引物(primer): 提供3-OH使dNTP聚合 其他的酶和蛋白
4、质因子,一、复制的化学反应,目 录,磷酸二酯键的生成,+dN2TP,+PPi,DNA pol,聚合反应的特点：,聚合,新链的延长只可沿53方向进行。,DNA新链生成需引物和模板；,全称：依赖DNA的DNA聚合酶 (DNA-dependent DNA polymerase, DDDP) 简称：DNA-pol,活性：1. 53 聚合活性2. 核酸外切酶活性,二、DNA聚合酶,DNA-pol 的 53聚合作用,15/62,35外切,5 3外切,5,3,内切酶(Endonuclease) （限制性内切酶）,35外切,5 3外切(Exonuclease),外切酶与内切酶作用图解,16/62,1. 原核生
5、物的DNA聚合酶,共同点：1. 53 的聚合活性2. 35 外切酶活性,DNA-pol,DNA-pol ,DNA-pol ,功能：对复制中的错误进行校读，对复制和 修复中出现的空隙进行填补。,DNA-pol （109kD）,DNA-pol I 5 3外切酶活性的功能,切除引物，切除突变片段,17/62,DNA-pol I 35外切酶活性的功能,校读（proofread）功能,17/62,323个氨基酸,小片段,5 核酸外切酶活性,大片段/Klenow 片段,604个氨基酸,DNA聚合酶活性 5核酸外切酶活性,N 端,C 端,DNA-pol ,Klenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研
6、究中常用的工具酶。,DNA-pol （120kD）,DNA-pol II基因发生突变，细菌依 然能存活。它参与DNA损伤的应急状态修复。,功能:是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。,DNA-pol (250kD),DNA-po l 同时合成领头链和随从链,段,2. 真核生物的DNA聚合酶,DNA-pol ,起始引发，有引物酶活性。,延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。,参与低保真度的复制。,在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。,仅存在于线粒体DNA复制中。,DNA-pol ,DNA-pol ,DNA-pol ,DNA-pol ,三、复制的保真性 (fidelity),1. 遵守严格的碱
7、基配对规律,2. 聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能,DNA pol 靠其大分子结构协调非共价(氢键)与共价键(磷酸二酯键) 的有序形成。嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应的嘧啶形成氢键配对时，嘌呤应处于反式构型。,DNA pol III 在催化磷酸二酯键形成之前完成对碱基的选择；对反式嘌呤核苷酸的亲和力较顺式的大。,3. DNA-pol的核酸外切酶活性和及时校读,A：DNA-pol 的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正确配对的底物。 B：碱基配对正确，DNA-pol不表现活性。,解链酶类：,解螺旋酶,拓扑异构酶,单链DNA结合蛋白,四、复制中的解链和DNA分子拓扑学变化,引
8、物酶,1. 解螺旋酶 (helicase),作用：断裂互补碱基间的氢键，使DNA成单链。,DnaA、B (rep蛋白、解螺旋酶)、C等,解螺旋酶,ATP,2. 单链DNA结合蛋白 (single stranded DNA-binding protein, SSB),作用：防止单链DNA重新形成双链，防止 单链DNA被核酸酶水解。,3. 引物酶 (primase),催化RNA引物合成的酶叫引物酶，它是一种特殊的RNA聚合酶。,DNA合成需在RNA引物的基础上进行。,4. DNA拓扑异构酶 (topoisomerase, Topo),DNA正超螺旋与负超螺旋,负超螺旋,正超螺旋,DNA双螺旋,拓扑
9、异构酶,解链过程中正超螺旋的形成,解链过程中正超螺旋的形成,拓扑异构酶作用特点 既能水解 、又能连接磷酸二酯键,拓扑异构酶拓扑异构酶,分 类,切割DNA双链，此时不需ATP；尔后由ATP供能，使DNA分子成负超螺旋再连接切口。,不需ATP，切割双链DNA中的一链，使DNA松弛后, 连接切口。,Topo:,Topo:,临床上使用的某些抗肿瘤药（如喜树碱，鬼臼乙叉甙等）是通过抑制Topo酶活性而杀死肿瘤细胞的。,作用机制,五、DNA连接酶 (DNA ligase),作用方式,催化DNA双链的3羟基和相邻的5磷酸基团形成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连成完整的链。,DNA连接酶,ATP,ATP
10、,HO,5,3,3,5,DNA连接酶,ATP,AMP+PPi,5,3,5,3,目 录,在复制中起最后接合缺口的作用；在DNA修复、重组及剪接中起缝合缺口作用；基因工程的重要工具酶之一。,功能,参与DNA复制的主要成员,主要成员,主要作用,DnaA,DnaB (解螺旋酶),SSB,DnaG (引物酶),TOPO,DNA-pol ,DNA-pol,DNA连接酶,DnaC,识别复制起始位点,解开DNA双链,运送和协同DnaB,合成RNA引物,维持已解开单链DNA的稳定,使打结、缠绕、正超螺旋的DNA松驰,DNA复制,水解引物、填补空隙、修复作用,催化双链DNA中单链缺口的连接,DNA生物合成过程 T
11、he Process of DNA Replication,第三节,复制的起始 复制的延长 复制的终止,（一）复制的起始 (initiation ),需要解决两个问题：,1. DNA解开成单链，提供模板。,2. 合成引物，提供3-OH末端。,一、原核生物的DNA生物合成,由特定蛋白质识别复制起始位点(ori)，在解螺旋酶、TOPO酶及单链DNA结合蛋白的共同作用下，DNA解链，解旋，形成复制叉。,倒Y,1. DNA解链,E.coli复制起始点 oriC,E.coli复制起始点oriC跨度为245bp，有3组串联重复序列和2对反向重复序列。,E.coli复制起始点 oriC,Dna A,SSB,
12、复制叉的形成,含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。,2. 引发体的生成,3,5,3,5,引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。,引物,引物酶,3. RNA引物合成,（二）复制的延长 (elongation),复制的延长指在DNA-pol 催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。,3AAGACCTATT5,5TTCTGGATAA3,dATP,+,DNA pol,OH 3,3,领头链的合成,随从链的合成,阶段一,阶段二,阶段三,阶段四,1. 原核生物基因是环状DNA，双向复制的汇合点就是复制的终止点。
13、,（三）复制的终止,2. 领头链上的RNA引物被RNA酶水解后，由DNA pol I 催化，由新合成链提供3-OH补齐。,3. 随从链上不连续性片段的连接,真核生物每个染色体是多复制子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活。 复制的起始需要DNA-pol和pol参与。还需拓扑酶和复制因子 (replication factor, RF)。 增殖细胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen, PCNA)在复制起始和延长中起关键作用。,（一）复制的起始,二、真核生物的DNA生物合成,领头链,随从链,（二）复制的延长,染色体DNA呈线状，复制在末端停止。复制中
14、岡崎片段的连接，复制子之间的连接。染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物，去除后留下空隙。,（三）复制的终止,5,3,3,5,5,3,3,5,+,5,3,3,3,3,5,5,5,染色体复制危机,反转录酶 (reverse transcriptase),反转录 (reverse transcription)现象,一、反转录病毒和反转录酶,又称为逆转录酶，为依赖RNA的DNA聚合酶， (RNA-dependent DNA polymerase, RDDP),反转录酶是多功能酶，有三种酶活性：,1. 反转录活性：即以RNA为模板合成DNA,2. RNase活性：水解RNA:DNA中的RNA,3.
15、 DNA pol活性：以DNA为模板合成DNA,反转录病毒细胞内的逆转录过程,分子生物学研究可应用反转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法称为cDNA法。,以mRNA为模板，经反转录合成的与mRNA碱基序列互补的DNA链。,试管内合成cDNA,cDNA complementary DNA,二、反转录研究的意义,反转录酶和反转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。 反转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样兼有遗传信息传代与表达功能。 对反转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意到的病毒致癌理论。,三、端粒酶,端粒(telomere),指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构,对外: 抵御核酸酶等外界 因素的袭击,保护染色体结构和功能的完整性,染色体,对内: 染色体DNA的 末端复制问题,结构特点,由末端单链DNA序列和蛋白质构成。末端DNA序列是多次重复的富含T、G碱基的短序列。,端粒酶 (telomerase),端粒酶RNA (human telomerase RNA, hTR) 端粒酶协同蛋白 (human telomerase associated protein 1, hTP1) 端粒酶反转录酶 (human telomerase reverse transcriptase, hTRT),
