药物质量控制分析方法验证技术指导原则

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1、第十四章 生物药物质量控制分析方法验证,1,第十四章 生物药物质量控制分析方法验证,一、概述 二、生物学测定常用方法 三、方法的来源 四、分析方法 五、分析方法的验证 六、综合分析,2,链霉素,3,一、概述,保证药品安全、有效、质量可控是药品研发和评价应遵循的基本原则，其中，对药品进行质量控制是保证药品安全有效的基础和前提。 方法验证的目的是判断采用的分析方法是否科学、合理，是否能有效控制产品的内在质量。,4,生物药品质控,生物药品质控中采用的方法包括理化分析方法和生物学测定方法。 一般要使用动物、细胞或生物分子，因此对于生物学测定的判断标准可适当灵活掌握 对于定量测定方法应尽可能减少方法的变

2、异，验证的结果仍应能证明该方法具有相当的准确性和可靠性，并应以能够有效控制产品质量为基本标准。,5,二、 生物学测定常用方法,生物学测定系指采用生物学方法，以反映被测物的生物学特性为目的的测定方法。,6,（一）、酶反应试验 是指在体外能促进酶分子的活化或本身具备酶的活性，通过底物的变化检测酶活性。主要用于酶、辅酶、激酶、激活剂、抑制剂等的活性测定。这类方法的变异相对较小，结果比较准确。,7,（二）、结合试验 是基于产品与某种物质的结合特性而设计的试验，如免疫结合试验。目前主要用于生物制品的鉴别。由于在结合试验中测定的分子不一定都具有生物活性，所以一般不用作制品的活性（或效力）测定。这类方法的变

3、异也相对较小。,8,（三）、细胞测定试验 是指产品可以诱导细胞产生可测定的应答，如细胞增殖、聚集、分化、死亡、迁移或产生特定的化学物质等。细胞测定试验一般能较好地反映制品的生物学活性，常用于各种生物制品的活性（效力）测定。与上述两类方法相比，这类方法的变异较大。与使用传代细胞相比，使用原代细胞的方法变异更大。,9,（四）、动物试验 是指以整体动物为试验材料检测制品生物学活性（或效力）的试验方法，如动物保护力试验，一般用于疫苗的效力测定。由于动物实验的成本高、周期长和变异大，所以一般仅用于成品检定。对于某些治疗用的制品，由于其作用机理或本身化学性质的原因，难以建立体外测活的方法，也可以采用动物试

4、验方法测定，但由于这类方法的变异一般相对较大，在进一步的研究中应尽可能以体外法代替。,10,鉴于一种测定方法仅能反映制品某一方面的特性，且方法的变异一般较大，为更好控制产品质量，必要时需同时采用多种方法进行测定。,11,三、方法的来源（种类）,根据质控分析方法的来源，可将方法分为两大类，即标准方法和非标准方法。原则上，对于各类方法均需进行验证，但依方法来源的不同对于验证的要求有所不同。,12,（一）、标准方法（或正式方法、法定方法） 一般是指已有国家标准的质控方法，WHO推荐的质控方法也可作为重要参考。此类方法在被确定为标准方法前已经过了适当的验证。 采用此类方法前，也应对该方法进行适当的验证

5、,如进行专属性和精密度的验证，以便证明在实际的使用条件下该方法也是适用的。,13,（二）、非标准方法 1、标准方法的替代方法 此类方法系指由申报者提出的可取代标准方法的替代方法。申报者在决定采用此类方法时应持慎重的态度，并需提供表明新方法等同于或优于原方法的依据以及全面的验证资料，包括两种方法的比较性资料。,14,2、来自参考文献的方法 是指在专业杂志或著作上发表并介绍的方法，一般要认真对待此类方法，并需进行全面的验证。应说明参考文献的出处，附原文及译文。,15,3、自己建立的方法 对于某些产品，尤其是创新性产品来讲，由于缺少可参考的方法，通常需要自己建立一种新的分析方法，对于这类方法需进行全

6、面而严格的验证。,16,四、分析方法,生物药品质控分析方法的准确性和可靠性与技术方法本身（包括方法的原理和方法的技术特点等）密切相关，一种系统的完整的分析方法应包括：,17,（一）、分析方法的原理 （二）、供试品 应说明如何取样，包括每次测定时取样的数量、如何取用（单支或多支混合）等。 （三）、测试用仪器及参数 （四）、测试用试剂 列出所有测试用的试剂和规格，并说明其来源。如果某些试剂为自制或对采购的试剂进行了加工处理，则应详述制备或处理过程。,18,（五）、标准品或参考品的配备 （六）、供试品的配备 ： （七）、测试过程 按实验步骤详述整个实验过程，说明关键步骤的实验条件。 （八）、计算 尽

7、可能以表格的形式显示所获取的数据，说明数据的处理方法，提供计算公式，并说明计算方法的出处及采用依据。 （九）、结果报告 ：说明结果报告的形式 （十）、判定标准：提供判定标准，说明判定标准的制定依据。,19,五、分析方法的验证,质控分析方法的验证就是根据方法的需要测定该方法的专属性、准确性、精密度、线性、范围、检测限度、定量限度、耐用性等几个指标中的一个或几个，用于不同检测目的的试验方法需进行不同参数的测定，下表为各种检测方法通常需测定的参数。,20,21,（一）专属性,专属性系指在其他成分（如杂质、降解物、辅料等）可能存在下，采用的分析方法能够准确测定被分析物质的特性的能力。 通常鉴别、杂质检

8、查、含量测定方法中均应考察其专属性。 如采用的方法不够专属，应采用多个方法予以补充。,22,1、鉴别反应,专属性试验要求证明能与可能共存的物质或结构相似化合物区分，需确证含被分析物的样品呈正反应（可与已知对照物比较），而不含被测成分的样品呈负反应，以及结构相似或组分中的有关化合物，也应呈负反应。,23,2、杂质检查,作为纯度检查，所采用的分析方法应确保可检出被分析物中杂质的含量，如有关物质、重金属、残留溶剂等。因此杂质检查要求分析方法有一定的专属性。,24,杂质可获得: 可向供试品中加入一定量的杂质，证明杂质与共存物质能得到分离和检出，并具适当的准确度与精密度。 杂质或降解产物不能获得: 将供

9、试品用强光照射，高温，高湿，酸、碱水解及氧化的方法进行破坏（制剂应考虑辅料的影响），比较破坏前后检出的杂质个数和量。必要时可采用二极管阵列检测和质谱检测，进行色谱峰纯度检查。,25,3、含量测定,含量测定目的是得到样品中被分析物的含量或效价的准确结果。 在杂质可获得的情况下，对于主成分含量测定可在供试品中加入杂质或辅料，考察测定结果是否受干扰，并与未加杂质和辅料的试样比较测定结果。,26,在杂质或降解产物不能获得的情况下，可采用另一个经验证了的或药典方法进行比较，比对两种方法测定的结果。也可采用破坏性试验（强光照射，高温，高湿，酸、碱水解及氧化），得到含有杂质或降解产物的试样，用两种方法进行含

10、量测定比较测定结果。必要时进行色谱峰纯度检查，证明含量测定成分的色谱峰中不包含其他成分。,27,（二）准确度,准确度系指用该方法测定的结果与真实值或认可的参考值之间接近的程度。有时也称真实度。一般以回收率（）表示。 一定的准确度为定量测定的必要条件，因此涉及到定量测定的检测项目均需要验证准确度，如含量测定、杂质定量试验等。,28,准确度应在规定的范围内建立。该指标的验证一般以回收率试验来进行，试验设计需考虑在规定范围内，制备3 个不同浓度的样品，各测定3 次，即测定9 次，报告已知加入量的回收率（）或测定结果平均值与真实值之差及其可信限。,（二）准确度,29,回收率,回收试验 可在几份相同试样

11、中加入适量待测组分的纯品，以相同条件进行测定，按下式计算回收率： 回收率添加组分试样测定值原试样测定值/组分添加量 回收率越高则认为方法越可靠。,30,1、含量测定 原料药可用已知纯度的对照品或样品进行测定，或用本法所得结果与已建立准确度的另一方法测定的结果进行比较。 制剂可用含已知量被测物的各组分混合物进行测定。,（二）准确度,31,2、杂质定量试验 杂质的定量试验可向原料药或制剂中加入已知量杂质进行测定。 如果不能得到杂质或降解产物，可用本法测定结果与另一成熟的方法进行比较，如药典标准方法或经过验证的方法。 当杂质的光谱与主成分的光谱相似，则可采用原料药的响应因子近似计算杂质含量（自身对照

12、法）。并应明确单个杂质和杂质总量相当于主成分的重量比（）或是面积比（）。,32,33,（三）精密度,精密度系指在规定的测试条件下，同一均质样品，经多次取样进行一系列检测所得结果之间的接近程度（离散程度）。 该指标目的是考察分析方法在不同的时间、操作人员、试验室下，所得结果的重现性和重复性。涉及定量测定的项目考察方法的精密度。,34,精密度一般用偏差、标准偏差或相对标准偏差表示。取样测定次数应有统计学意义，至少用6次结果进行评价。 精密度可以从三个层次考察：重复性、中间精密度、重现性。,（三）精密度,35,1、重复性,重复性系指在同样的操作条件下，在较短时间间隔内，由一个分析人员测定所得结果的精

13、密度。 重复性测定可在规定范围内，至少用9 次测定结果进行评价，如制备3 个不同浓度的样品，各测定3 次，或采用同一批样品（把被测物浓度当作100），用至少测定6 次的结果进行评价。,36,2、中间精密度,中间精密度系指在同一试验室，由于试验室内部条件改变，如时间、分析人员、仪器设备、测定结果的精密度。 验证设计方案中的变动因素一般为日期、分析人员、设备。,37,38,3、重现性,指不同实验室之间不同分析人员测定结果的精密度。 当分析方法将被法定标准采用时，应进行重现性试验。,39,（四）线性,线性系指在设计的范围内，检测结果与试样中被分析物的浓度（量）直接呈线性比例关系的能力。 线性是定量测

14、定的基础，涉及定量测定的项目，如杂质定量试验和含量测定均需要验证线性。 做法: 可用一贮备液经精密稀释，或分别精密称样，制备一系列被测物质浓度系列进行测定，至少制备5 个浓度。以测得的响应信号作为被测物浓度的函数作图，观察是否呈线性.,40,（五）范围,范围系指能够达到一定的准确度、精密度和线性，测试方法适用的试样中被分析物的高低限浓度或量的区间。 范围通常用与分析方法的测试结果相同的单位（如百分浓度）表达。 涉及到定量测定的检测项目均需要对范围进行验证，如含量测定、含量均匀度、溶出度或释放度、杂质定量试验等。,41,1、含量测定 范围应为测试浓度的80100或更宽。 2、杂质 杂质测定时，范

15、围应根据初步实测，拟订出规定限度的20。如果含量测定与杂质检查同时测定，用面积归一化法，则线性范围应为杂质规定限度的-20至含量限度（或上限）的+20。,（五）范围,42,（六）检测限,检测限系指试样中的被分析物能够被检测到的最低量，但不一定要准确定量。 该验证指标的意义在于考察方法是否具备灵敏的检测能力。因此对杂质限度试验，需证明方法具有足够低的检测限，以保证需要控制的杂质被测出。,43,1、直观法 直观评价可以用于非仪器分析方法，也可用于仪器分析方法。 检测限的测定是通过对一系列已知浓度被分析物的样品进行分析，并以能准确（或被可靠）地检测被测物的最小量或最低浓度来建立。,（六）检测限,44

16、,2、信噪比法 用于能显示基线噪音的分析方法，即把已知低浓度试样测出的信号与空白样品测出的信号进行比较，算出能被可靠地检测出的最低浓度或量。一般以信噪比为3：1 或2：1 时相应的浓度或注入仪器的量确定检测限。 其他方法有基于工作曲线的斜率和响应的标准偏差进行计算的方法等。,（六）检测限,45,（七）定量限,定量限系指试样中的被分析物能够被定量测定的最低量，其测定结果应具有一定的准确度和精密度。 常用信噪比法确定定量限。一般以信噪比为10：1 时相应的浓度或注入仪器的量进行确定。,46,1、直观法 直观评价可以用于非仪器分析方法，也可用于仪器分析方法。定量限一般通过对一系列含有已知浓度被测物的样品进行分析，在准确度和精密度都符合要求的情况下，来确定被测物能被定量的最小量。,（七）定量限,47,2、信噪比法 用于能显示基线噪音的分析方法，即把已知低浓度试样测出的信号与空白样品测出的信号进行比较，算出能被可靠地检测出的最低浓度或量。一般可接受的信噪比是10：1。,（七）定量限,48,（八）耐用性,耐用性系指测定条件发生细小变动时，测定结果保持不受影响的承受程度。 耐用性主要考察方法本身对于可变试验因素的抗干扰能力。开始研究分析方法时，就应考虑其耐用性。如果测试条件要求苛刻，则建议在方法中予以写明。,