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1、FasFas、FasLFasL 在特发性血小板减少性紫癜在特发性血小板减少性紫癜 患者患者 T T 细胞亚群表达的研究细胞亚群表达的研究(1)(1)作者：洪丽，鲁田夫，吴立连，胡艳明【摘要】 目的探讨 Fas、FasL 在特发性血小板减少性紫癜患者 T 细胞亚群及血小板中的表达状况及其在 ITP 发病机制中的作用。方法收集 ITP 患者及健康人群外周抗凝静脉血，分离纯化得 T 细胞和血小板。以 PE 标记的antiCRTH2mAb 和 Cy5 标记的 antiCD4、CD8mAb 及 FITC标记的 antiFas、FasLmAb 做三色流式细胞术，分析 ITP患者 Th/Tc、Th1/Th2
2、、Tc1/Tc2 细胞 Fas、FasL 表达的变化;以 FITC 标记的 antiFas、FasLmAb 作单色流式细胞术，分析 ITP 患者血小板 Fas、FasL 表达的变化。结果与健康人群相比，ITP 患者外周血 Th、Th1、Th2 细胞百分率均明显下降，Tc、Tc1、Tc2 细胞百分率均无明显变化;Th、Th1、Th2 及 Tc、Tc1、Tc2 细胞 Fas、FasL 表达均明显升高;同时，ITP 患者血小板 Fas 的表达明显升高，而 FasL的表达无明显变化。结论 ITP 患者存在免疫功能失调，T 细胞亚群及血小板 Fas、FasL 表达异常可能与 ITP 患者免疫病理机制有关
3、。【关键词】 特发性血小板减少性紫癜;Fas/FasL;T 细胞亚群;血小板ABSTRACT：ObjectiveToinvestigatedtheexpressionofFas,FasLonTcellsubsetsandthrombocyteinpatientswithidiopathicthrombocytopenicpurpuraanditsroleinITPpathogenesis.MethodsAnticoagulatedvenousbloodbyheparinwascollectedfromidiopathicthrombocytopenicpurpurapatientsandhea
4、lthypeopleandTcellsandthrombocyteswereseparatedbyHumanCD3+Tcellenrichmentcolumn.TheexpressionofFas,FasLonTcellsubsetswasdetectedbyimmunofluorescencestainingandthreecolorflowcytometrybyFas/CD4,FasL/CD4,Fas/CD8andFasL/CD8gating.TheexpressionofFas,FasLonthrombocyteswasmetriedbyimmunofluorescencestainin
5、gandmonocolorflowcytometrybyFasandFasLgating.ResultsComparedwithhealthypeople,thepercentageofTh,Th1andTh2cellsinperipheralbloodofITPpatientswasmarkedlydecreased,andtheexpressionofFas,FasLonTh,Th1,Th2,Tc,Tc1andTc2wassignificantly,theexpressionofFasonthrombocyteswasalsosignificantlyThereisimmunofuncti
6、ondisorderinITPpatients.,andtheabnormalexpressionofFas,FasLonTcellsubsetsandthrombocytesmayinvolveinITPimmunopathogenesis.KEYWORDS：Idiopathicthrombocytopenicpurpura;Fas/FasL;Tcellsubsets;Thrombocyte特发性血小板减少性紫癜是一种自身免疫性疾病，发病机制包括 T、B 细胞的异常活化和 T 细胞依赖性自身抗体的产生。以往的研究表明，ITP 患者血小板的损伤主要与患者体内抗血小板相关抗体对血小板的损伤作用有
7、关1。近年来，人们发现，ITP 患者外周血激活的淋巴细胞增多、细胞凋亡不足与疾病的发生有关2，3。本研究旨在通过对ITP 患者 T 细胞亚群及血小板 Fas、FasL 蛋白表达的检测，以分析 T 细胞亚群及血小板 Fas、FasL 表达异常对细胞凋亡及其在 ITP 发病机制中的可能作用。CRTH2 是目前认为的Th2、Tc2 特异性表达标志物4，我们应用 PE 标记的抗CRTH2 单抗和 Cy5 标记的 CD4、CD8 作双色标记，分别以CD4+CRTH2+T、CD4+CRTH2+T、CD8+CRTH2-T 及 CD8+CRTH2+T细胞代表 Th1、Th2、Tc1 及 Tc2 细胞，以 CD
8、4+T、CD8+T 细胞代表 Th、Tc 细胞。1 材料与方法研究对象35 例 ITP 患者来自咸宁学院附属第一医院、第二医院、咸安区人民医院，其中男 16 例，女 19 例，年龄 240 岁，均符合 ITP 诊断标准5，并于用药前取外周抗凝血;正常对照 30 例，为健康人群，排除 ITP 及其它自身免疫性疾病，其中男 14 例，女 16 例，年龄 342 岁。试剂和仪器Cy5 标记的 antiCD4、CD8mAb 及小鼠抗人 IgG1 为 EB公司产品，PE 标记的 antiCRTH2mAb 及小鼠抗人 IgG1 为Miltenybiotec 公司产品，FITC 标记的antiFas、Fas
9、LmAb 及小鼠抗人 IgG1 购自 AC 公司，流式细胞仪为 Beckman 公司产品,T 细胞分离富聚柱购自易莱锦生物公司，淋巴细胞分液购自 AXISSHIELD 公司。方法外周血 T 细胞及血小板的分离无菌采集患者及正常健康人群外周静脉血 5ml，肝素抗凝，以淋巴细胞分液得淋巴细胞，采用溶血素溶解红细胞，经 T 细胞分离富聚柱得纯化的 T 淋巴细胞，用 20%的小牛血清 RPMI1640 培养液调整细胞浓度约 2106。SABC 免疫组化法检测其纯度大于 98%，台盼蓝拒染法检测其活性大于95%。上述步骤所得血浆经洗涤后用 20%小牛血清RPMI1640 培养液调整血小板浓度为 2106
10、。外周血 T 细胞亚群及 Fas、FasL 测定取 4 支试管，各加入 100lT 细胞悬液，4 管分别加入antiCD4Cy5、antiCRTH2 和antiFasFITC，antiCD4Cy5、antiCRTH2PE 和antiFasLFITC，antiCD8Cy5、antiCRTH2PE和 antiFasFITC，antiCD8Cy5、antiCRTH2PE和 antiFasLFITC，以上各管配备相应的对照管。混匀。4避光 30min，PBS 洗涤 2 次，各管加入缓冲液，上流式细胞仪检测。外周血小板 Fas、FasL 测定取 3 支试管，各加入 100l 血小板悬液，分别加入小鼠抗人
11、 IgG1FITC、antiFasFITC 和antiFasLFITC，混匀。4避光 30min，PBS 洗涤 2 次，各管加入缓冲液，上流式细胞仪检测。统计学分析所有数据以s 表示，两两比较采用成组 t 检验，经软件分析。2 结果外周血 T 细胞亚群的变化ITP 患者外周血 Th、Th1、Th2 细胞百分率较正常对照组均明显下降，Tc、Tc1、Tc2 细胞百分率均无明显变化。外周血 T 细胞亚群 Fas、FasL 检测结果Th、Th1、Th2 及 Tc、Tc1、Tc2 细胞 Fas、FasL 表达较正常对照组均明显升高。外周血血小板 Fas、FasL 检测结果ITP 患者血小板 Fas 的表达明显升高，而 FasL 的表达较正常对照组无明显变化。表 1 两组外周血 T 细胞亚群百分率比较与正常对照组比较,*P表 3 两组外周血 T 细胞亚群 FasL 表达百分率比较与正常对照组比较,*P表 4 两组外周血血小板 Fas、FasL 表达百分率比较（作者：未知本文来源于爬虫自动抓取，如有侵犯权益请联系 service立即删除）
