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1、无菌检查法第一讲 2000 版药典无菌检查法增修订内容概述无菌检查法是针对无菌制品的无菌性而建立起来的一套检查方法，早在 19 世纪初就列入了药品检查的要求项目，在人们不断实践的过程中，其方法也在不断地改进和提高，检查的范围和内容也逐步扩大。中国药典 2000 版就取样量、培养基质量、无菌环境、无菌操作技术等方面有大幅度的增订和修订，具体概括如下：1 扩大了检验范围：以往的无菌检查仅适用于药品及敷料，本次修订增加了肠线、缝合线及无菌器具，这就使一次性注射器、一次性输血输液器等有了切实可行的检验方法。2 对无菌检查的操作环境提出了明确的要求，规定操作应在 100 级单向流空气区域内进行，并且对单
2、向流空气区与工作台面要进行验证。3 培养基：在提法上将霉菌培养基更名为真菌培养基。因为霉菌培养基上常有酵母菌生长，霉菌和酵母菌都不是分类学上的名词，而只是一个形态学类群，是一种俗称，被习惯称为霉菌和酵母菌的两大类群微生物属于真菌门。将霉菌培养基更名为真菌培养基能更确切地反映这一培养基的适用范围。在制法上提出可按药典规定的处方自制，亦可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基。使用脱水培养基（合成培养基）可大大节省我们的工作量和工作时间，但应注意使用应严格按说明进行，灭菌温度和时间统一规定为 11530 分钟，同时注意 pH 值的变化，并逐批对培养基进行灵敏度检查。培养基灵敏度检查：这是对培养基的
3、质量性能进行检验的一个试验。此次修订增加了制备稀释菌液的一种方法，即直接稀释法，新增的第二法直接稀释法较第一法（比浊法）简单，人为误差小。对两种稀释法，2000 版药典都规定了菌液的最终浓度为 10100 个/ml而放弃了稀释级的提法，因此培养基接种管数减少，简化了工作量，明确了结果判断。4 对照用菌液:对照用菌液是无菌检查实验中加入阳性对照管的菌液2000 版药典对此项的改动与灵敏度实验相一致 也是将菌液的稀释级 10-6 改为最终稀释浓度 100 个/ml将金黄色葡萄球菌的接种培养基由需厌气培养菌改为营养肉汤培养基。5 抑细菌和抑真菌实验此项实验为本次修订时增设。在用直接接种法进行无菌检查
4、前，要测定供试品的抑菌性。增设该项实验是适应当前大量新药涌入临床，对这类药品进行无菌检查时，往往对其是否具有抑菌作用没有把握，如果其有抑菌性，就会造成我们检验结果的假阴性，国外药典都在无菌检查中设有此项内容。我国 2000 版药典增设该项内容，虽延长了无菌检查时间，但可以减少方法选择上的盲目性。因此具有很重要得意义。6 检查法在检查法的序言中，明确规定了直接接种法和薄膜过滤法的适用范围，前者适用于非抗菌作用的供试品，后者适用于有抗菌作用的或大容量的供试品。在进行无菌检查前，提出用适当的消毒液对供试品容器表面或外包装浸没或擦拭消毒。2000 版药典把它作为一个实验步骤提出来，较 95 版更明确具
5、体。（1）直接接种法：将 95 版的七大类供试品进行了简并（如 23 条简并为一条） ；增设了内容（如外科敷料中增设了肠线、缝合线；又专项增设了灭菌医用器具一条） ；调整了次序（将有抑菌作用和抗生素类药品从直接接种法中删除，而其相应的内容在薄膜过滤法中体现出来） 。对青霉素类药品叙述了两种方法都可使用，而不是只用酶法；放射性药品没有变更。经过调整，最终将供试品归纳为六类，调整后的款项，内容丰富，归类合理。在直接接种法中，最大的变动是取样量的增加和培养基管数的增加，这是本次修订无菌检查法的重要改动，并为此专门增设了表格附后。从理论上讲当某批产品染菌率一定时检出有菌的概率随样本数量的增加而增加95
6、 版进行无菌检查时一般取用 2 个容器在这种样本数下通过无菌检查的可能性很大而这时所下的无菌结论其假阴性率比较高2000 版将取样量增加到 11 个容器接种量从全量到 5ml 不等对敷料由原两个包装增加到 4 个包装原来剪取以面积计 改为以重量计或面积计。培养基接种管数由原来的共 7 管调整到共 11管 其中真菌培养管由原来的 2 管增加到 5 管培养时间均设为 7 天延长了细菌原来 5 天的培养时间这样的修订统一了细菌和真菌的操作提高了阳性检出率。对加入供试品后培养基出现浑浊这一情况的处理方法2000 版药典明确规定经 7 天培养后 可转种或可显微观查 而不是两种方法同时使用。（2）薄膜过滤
7、法:本法将取样量由 2 支增加到 6 支将供试品由抗生素类药品、抗厌氧菌药品、抗真菌药品统一规定为有抗菌作用的药品并统一操作只是在加入阳性对照菌时根据供试品的特性加入不同的菌液，在冲洗时没有统一规定冲洗次数及冲洗剂用量而以冲洗至阳性对照菌能生长为标准 这就需要依靠经验来操作。阳性对照菌生长出来的时间规定为细菌 2448hr真菌 2472hr。在使用的仪器装置上既可使用传统的装配式滤器也可使用封闭式滤器后者是本次修订时新出现的仪器由于推荐使用的 JBY-型电脑集菌仪有三组培养基分别培养细菌、真菌和阳性对照 因此相应的传统式滤器操作取出滤膜后分成三等份而改变了以往分为四等份。7 阴性对照:中国药典
8、 95 版的无菌检查法中规定取一支需厌气培养基作为阴性对照即可。这一规定明显欠准确既不能指示可能存在的细菌污染更无法在薄膜过滤法中对滤器、滤膜、溶剂、冲洗剂等起到阴性对照的作用因此 2000 版对阴性对照做了更为准确的规定即应取相应溶剂 稀释剂同时操作阴性对照与样品的唯一区别只是它不含供试品。第二讲 无菌检查的慨述一、无菌检查的定义及范围:无菌检查法是指检查药品、敷料、缝合线、无菌器具及药典要求无菌检查的其它品种是否无菌的一种方法一般来说凡直接进入人体血液循环系统、肌肉、皮下组织、创伤、溃疡等部位而发生作用的制品都要进行无菌检查。需要进行无菌检查的药品、敷料、器具的范围主要有以下几类:1 各种
9、注射剂:用于肌肉、皮下和静脉的各种针剂，包括注射用的无菌水、溶媒和溶剂、还有输液和注射剂原料等。2 眼用及外伤用制剂：用于眼科手术、角膜创伤及一般创伤、溃疡和烧伤等外科用药品制剂。许多国家对这类制剂规定为无菌，我国也基本如此，但中成药中含有生药原粉的这类制剂达不到要求，则以染菌限度要求。3 植入剂：即用于包埋于人体内的药物制剂，如不溶于水的激素、避孕药物、免疫药物及抗肿瘤药物等要求无菌的制剂。4 可吸收的止血剂：如明胶发泡剂、凝血酶等用于止血并可被组织吸收的各种药物制剂。5 外科用的敷料、器材等：如外伤用脱脂棉、纱布、结扎线、缝合线、可被吸收的羊肠线及一次性注射器、一次性无菌手术刀片、输血输液
10、袋、博士伦、心脏瓣膜、以及金属和有机器材等。二、无菌检查的意义：由于微生物形体微小，适应能力强，因而它们在自然界广泛分布，与动植物共生，互惠互利，但也正因为它们分布广泛，有时也给我们带来不利影响，就我们医药行业来说，外科手术时，如果手术器械灭菌不彻底，会造成伤口化脓感染；制药时如果灭菌不彻底，染菌药品进入人体后会引起一系列疾病，临床上发生因输染菌的葡萄糖造成败血症死亡的报道，国内外都有，因此人们很早就认识了药品微生物检验的重要意义，早在本世纪初就列入了检验要求项目，现在各国药典都对无菌检查范围、内容、方法、抽样有明文规定，以保证无菌用药的安全性。三、无菌检查的抽样：（一）抽样的意义：无菌检查的
11、抽样，是指从一批产品中抽取一定数量单位的样品，作为检验样本的方法，各种要求无菌的药品在出厂前，应通过无菌检查，以保证产品的质量。但由于每批产品的数量众多，还由于现有的知识及检测手段的限制，提供不了非破坏性确认批量产品中每一个最终制品的微生物质量的方法，因此通常只能从每批产品中随即抽取一定数量的单位产品，作为样本检验，以此结果来判断整批产品的质量。从理论上讲，无菌产品应是没有微生物污染的产品，但实际上，被称为无菌批的产品中，往往不是绝对无菌，而是有可能存在某种程度的污染，建立在概率论基础上的抽样方法不管多么完善，均存在风险，而这种风险随抽样量的增加而减少，随着微生物污染程度的降低而增大。假如一个
12、批中有 10 的产品受到污染，从这个批中取一个成品样本做无菌检查，存在两种可能性，取到无菌样品或取到染菌样品，取到无菌样品的概率（P）为 09，取到染菌样品的概率 q 为 01。则 pq0901110如从这个批中取 2 个成品样本做无菌检查则存在三种可能，2 个无菌样本，2 各染菌样本，1 各无菌样本和 1 个染菌样本，以三种可能组合的概率可按下式计算：（pq）2p22pqq2 将 p09q01 代入即得 p2081 取得两个无菌样本的概率q2001 取得两个染菌样本的概率2pq018 取得 1 个无菌，1 个染菌样本的概率因此，当样本数为 2 时，这个 10 染菌的批抽不到染菌样本的概率 p
13、2081抽到染菌样本的概率 q22pq019。在无菌检查中，一个染菌批，设样本数为 n，通过无菌检查的概率和这个染菌批被检查出来的概率为：pn（1-q）n 通过无菌检查的概率（合格）1-pn1-（1-q ）n 检出批染菌的概率（不合格）q 系指批产品的染菌概率，与生产工艺提供无菌保证的能力有关。例：某产品的染菌率由下降到、，抽样样本数为，根据无菌检查判断批无菌的风险是升高还是降低？当时，通过无菌检查的概率（1-q）n1-03249当 1时，通过无菌检查的概率（1-q）n1-01281当 5时，通过无菌检查的概率（1-q）n1-0052903结果，根据无菌检查判断批无菌的风险升高，即误判为合格的
14、概率由上升到3例 2 同一个污染水平下，增加无菌检查的样本数，无菌检查的可信度是升高还是降低，如 10 污染率，样本数为 2、5、10。样本数通过概率可信度（不合格品检出率）n2 时（1-01）28119n5 时（1-01）55941n10 时（1-01）103565结果可信度提高 即不合格品检出率提高。表 1-1 样本数、污染率与通过无菌检查概率的关系抽样数污染率 qn05125101520253019959998959085807570299989690381726456495975959077594636241610959081593521126281593867246219413052
15、0918264361241310-1810-2258878602871704710-2110-230867049215420701210-2210-350786134007005002001510-5210-6从以上分析看出，无菌检查是有局限性的，当无菌检查结果为符合规定时，其意义是相对的，对于无菌制剂，除加大抽样以提高无菌检查的可信度外，最根本的办法是严格执行 GMP 管理制度，加强生产环节的管理。（二）抽样的方法与抽样量：在抽样时，对产品的分批应特别注意。对无菌检查而言一个批量应以同一灭菌器的产品为一批，无菌制剂应以无菌灌装相同的最终容器，在连续不间断生产，以不超过 24 小时的时间周期内
16、的产品为一批，在连续生产过程中产品分别连续灭菌，如 r-射线灭菌应以不超过 24hr 的总产量为一批，不同机器生产的，以各机的产品分批，不同班组生产的，应按班组分批，这样分批的意义是使各批号的产品具有均匀性，随即抽样时则有代表性。此外尚有其它管理方面的意义。以同一灭菌器中的产品分为一批时，应从不同部位抽取单位产品组成样本。连续生产过程中，应有不同时间抽样组成样本。抽样方法基本上可分为三种类型：1 百分数抽样法：本法抽样是根据统计学概率的估算，确定随机抽样的数量，如按WHO 于 1975 年建议的原则，英国药典 1998 版的抽样量（表 2-2） ，按各批单位产品的数量确定每批的抽样量，每批的抽样量为批量 5 左右，高者不超过 20，低者可在 2 以下。2 固定抽样法：每批样品皆抽取固定
