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1、丙型肝炎进展,海南中医药研究所附属琼岛医院肝病中心,l HCV是非甲非乙型肝炎的主要病因 l 起病隐匿，临床表现轻微，常导致慢性肝炎。 l 全球约1.7亿人感染过HCV l 1%2%的美国人有HCV感染 l 我国乙型肝炎仍占大多数 l HBV重叠HCV感染的临床表现及病理改变更加严重,概述,HCV的发现,l 70年代中期发现为非甲非乙型肝炎 l 约2/3输血后肝炎是由非甲非乙型肝炎病毒所致 l 1978黑猩猩非甲非乙型肝炎模型确定是由病毒 引起 l 病毒生物学分子特性与黄病毒相似，后被命名为HCV,HCV基因结构,5NC 3010-3033aa 3NC,341nt,衣壳 高变区 包膜 疏水膜
2、解旋酶 疏水 膜蛋白 RNA多聚酶蛋白 蛋白 蛋白,HCV基因结构模拟图,l 3NCR-高度变异、Poly(u)、Poly(u/c)及98个 碱基高度保守区组成 l 5NCR-340核苷酸组成，形成一个环柄杆结构(stem-loop) l两端中间为开放读框(ORF)-9000个核苷酸 l E1编码的糖蛋白可能不是单一蛋白，而有二种或更多 l 3端的ORF编码的非结构蛋白，至少包括6种蛋白，包括蛋白酶、解旋酶、多种RNA聚合酶及调节肽等 l 4a基因产生的调节肽具有多种功能,HCV基因结构的异质性,E1区域，又称第一高变区(Hypervariable region ,HVR1)90nt 有些病毒
3、存在着第二高变区(HVR2)，即在E2/NS1区域近3-末端处21nt,基因型(Genotype),Okamoto-1,2,3,4型Enomoto-PT,K1,K2a,K2b型Simmonods-1a,1b,2a,2b型,l HCV至少存在6个基因型 l HCV亚型已超过50个，最常见的为1a,1b,2a,2b亚型1,2,3型及其亚型分布世界各地：4型主要分布在非洲，是扎伊尔及埃及的主要基因型 l 5型是南非的主要基因型 l 6型及其亚型主要发现在亚洲,HCV慢性感染与体液免疫,HCV不能诱导保护性免疫 HCV感染后恢复期的黑猩猩不能防止8种同种或异种HCV再感染 HCV慢性感染的人或黑猩猩可
4、多次发生急性丙肝或异种HCV重叠感染,HCV诱导的持续慢性的机理,宿主因素，如不能诱发保护性免疫 病毒因素，如病毒变异 与HCV-RNA整和到宿主基因无关 HCV诱导的宿主细胞及体液免疫反应不能预防及清除HCV感染,HCV准基因株(Quacispecies),大多数RNA病毒在复制过程中，易出错 在同一个体内很难找到完全相同的RNA基因 基因之间关系甚密，这就是所谓准基因株 病毒准基因围绕主要基因，数量以主要基因为主 感染某一时期，各基因的分布状态代表宿主与病毒之间的最佳状态 主要基因起主要地位，是由于主要基因复制率较高之故 免疫靶基因不单是主要基因，而是基因的复合体,RNA病毒基因变异生物学
5、作用,免疫逃避作用，导致病毒的持续感染 耐药病毒株的产生 疫苗失败 减毒活疫苗恢复致病性等 HCV-RNA基因复杂程度与相关肝病进展有密切关系 准基因越复杂，干扰素疗效也越差,HCV准基因株与宿主免疫反应,宿主体液及细胞免疫压力 病毒复制出错 HCV基因变异 逃避宿主免疫系统攻击作用 HCV持续感染,HCV准基因株与宿主免疫反应,产生中和抗体 中和抗体清除病毒的能力极有限 对所分离的病毒有作用 对准基因复合体无效 HCV中和抗体主要作用部位在HVR1区 HVR1基因的变化是体液免疫作用的结果 最近又发现E2保守区（HVR1外区域）分离到中和抗体,丙型肝炎实验室诊断,HCV抗体测定 HCV抗体测
6、定的其他试验 分子生物学的检测 定性试验：检测血清中是否有HCV-RNA的存在 定量HCV-RNA测定：估计患者血清中HCV-RNA含量 HCV-RNA基因分型：确定HCV-RNA基因性质组织培养分离出的病原体对诊断非常有用,筛选试验HCV抗体测定,第一代HCV抗体 抗体检测用酶免疫测定法（EIA）-优点多，方便、重复性好、成本低 EIA-1是用HCV-NS4基因段重组抗原，命名为C100-3-敏感性及特异性均不理想 仅80%患者HCV抗体阳性 假阳性很高,筛选试验HCV抗体测定,第二代HCV抗体 EIA-2(1992)试验含有NS4、核心及NS3基因抗原-代表了多种抗原 敏感性及特异性有改善
7、 HCV血清阳转平均窗口期（window periods）明显缩短 血清阳转的平均时间 EIA-周左右EIA-1-16周 阳性率为95%,筛选试验HCV抗体测定,第三代HCV抗体测定 EIA-3含有重建核心和NS3抗原及NS5抗原 敏感性有增加(97%) 血清阳转时间为2-3周,HCV抗体测定的其他试验,第二代RIBA-抗HCV补充性试验 内含抗原与EIA-2相同 但以免疫印迹形式 结果可解释为阳性、可疑及阴性 高危人群中的抗HCV阳性标本，没有必要行补充试验 第三代补充试验（RIBA-3）其特异性更好,HCV-RNA定性试验,逆转录PCR RT-PCR方法各家不一，缺乏标准化 有许多因素影响
8、着PCR方法，如标本处理及储存形式，引物设计、扩增倍数、反应条件、DNA产物的污染、扩增后产物检测系统等 严格的质控、操作人员的熟练程度尤为重要 药盒并不能完全保证结果的可靠性,HCV-RNA定量试验,估价血清中HCV-RNA水平 反映感染机体的病毒复制率及清除率 在未治疗的慢性丙肝机体内病毒负荷相对稳定 目前有二种方法可定量HCV-RNA水平，即靶扩增技术如定量PCR方法及信号扩增技术如支链DNA法,HCV基因型测定,检测基因型方法一般分为二类 ： 检测HCV基因的点突变的筛选试验 评估HCV基因更大片段的验证性试验 HCV基因型的筛选试验有 ：(1)对HCV高度保守的5-NC区域行限制性片
9、段长度多 型性分析（RFLP）(2)对HCV-5NC区域行逆转录斑点杂交分析，又名LIPA方法(3)用型特异的引物对HCV核心基因巢式PCR。在临床应用中RFLP与LIPA差异较小。(4)病毒蛋白抗原性分型 评估HCV基因更大片段的验证性试验-序列分析,丙肝的临床诊断,抗HCV（EIA-2）+确诊 RIBA-2 PCR 肝穿 阴性 可疑 阳性 阳性 阴性 排除 PCR 肝穿 随访 排除,肝病严重程度的评估,肝活检-黄金标准 ALT水平-不能反映肝病的严重程度 血清HCV-RNA水平-不能评价肝病的严重程度 HCV基因型-HCV-1b型与严重肝病之间无关系,肝活检在丙肝中的作用,适应症 :(1)
10、 持续性或间歇性ALT异常6月 (2) 疑有其他肝病如酒精性、脂肪肝或血色病等 禁忌症： (1)凝血功能严重异常 (2)终末期肝病 肝活检的不利因素 :(1) 产生并发症 (2) 患者拒绝 (3) 费用,肝炎活动度的评价,丙肝的组织学特征 :脂肪变性 淋巴细胞浸润或淋巴滤泡形成 胆管损伤 非绝对，偶出现在慢乙肝或自体免疫性肝病中 所有报道的特征性改变有所差异,Knodell肝组织评分,半定量方法 ,包括4个特征 : 汇管区周围坏死（碎屑坏死）伴有或不伴有桥样坏死 肝实质细胞损伤 汇管区炎症 纤维化 评价肝炎症及纤维化的分级和分期系统即（G0-G4）（S0-S4） Knodell积分常用来排除主
11、观因素，但在实际应用中并不能完全排除,肝活检的重要性,是评价慢性丙肝自然史 为治疗方案的选择提供依据 预示干扰素治疗的反应率 决定何时开始、推迟或终止治疗 如果知道HCV感染时间，肝穿刺结果则可推知其肝病进展概率 有助于证实其他肝病 ，如酒精性、非酒精性脂肪肝或血色病等以便适当治疗,丙肝治疗后肝活检,目前仍没有统一意见。因此，除非特别需要（如第二次治疗开始），一般不作常规治疗后肝穿刺,ALT、HCV-RNA与肝组织学关系,ALT异常者肯定有慢性肝病的存在，但ALT正常者不能保证肝组织正常 ALT水平不能预示肝病严重程度 ALT水平不能预示肝组织内汇管区浸润、淋巴滤泡形成、胆管损伤及脂肪变性程度
12、 HCV-RNA水平与肝组织学改变之间无相关，不能预示肝病程度的严重性 关于血液检查各参数缺乏与肝组织相关的机理仍不清楚 ：肝组织学改变的形成是动态因素与静态因素综合之结果 ，而外周血参数的检测，只反应检测当时的情况 。,丙型肝炎与肝细胞癌,HCV相关HCC流行病学,HCV相关HCC主要发生在HCC发生率为中等的地区，如北欧及日本 在HCC发生率较高地区，HCC仍以HBV感染为主 在意大利、西班牙及日本，约50-75%的HCC与HCV感染有关 少数北欧国家如希腊，抗HCV阳性的HCC不到20% 美国各地区差异很大 来自南佛罗里达洲一份报告，50%以上的HCC中抗HCV阳性，许多患者为拉丁美洲人
13、 来自Alaska报告，仅极少数HCC中可查到抗HCV，HCC的主要原因仍为HBV感染 Baltimore研究报道，约16%HCC患者抗HCV阳性，并且大多数患者HCV-RNA阳性 los Angelos的非亚洲的HCC患者约33%抗HCV阳性,HCV引起HCC的机理,确切机理仍不清楚 HCV核心蛋白在体外具有某些直接致癌作用 ：能使鼠胚胎纤维母细胞转化为恶性细胞具有抑制凋亡作用 HCV基因型对HCC的作用不一 HCV相关HCC的发生与肝硬化有关 在各种原因所致的肝硬化中，其致HCC的危险性不一,HCV相关其他危险因素,HBV与HCV同时感染：发生HCC的相对危险为82.5，而单纯HCV感染其
14、相对危险性仅为6.6 饮酒：加剧慢性丙肝过程，加速发展成肝硬化，酒精可增加循环中HCV-RNA含量 卟啉病,临床表现,HBV相关HCC发病较HCV相关HCC为年轻 HBV相关HCC中常伴有肝硬化，而HCV相关HCC中几乎所有病例合并肝硬化 HBV相关HCC其癌肿常为单个，而HCV-HCC则开始就为多中心,HCC发生率,如果60%HCV感染患者发生慢性肝炎，其中20%患者在10年内发生肝硬化，则HCV感染患者的12%将发生肝硬化。如估计HCC每年发生的危险性为1-4%，则20年后，约1.2-4%的HCV感染者将发生HCC，而1.9-6.7%得慢性肝炎及9.6-33.5%的肝硬化患者将发生HCC。
15、,丙型肝炎的治疗,干扰素治疗,具有抗病毒、抗纤维化及免疫调节作用 抗HCV的确切机理仍不清楚 目前常用的有四种-干扰素，即-2a、-2b、-nI及-C 其他类型干扰素尚待进一步评价,-干扰素,-2b干扰素是用人白细胞-2b基因通过重组DNA技术产生而成 -2a干扰素也是人白细胞基因经重组DNA技术产生，但其基因结构与-2b只相差一个氨基酸 -nI干扰素是人淋巴母细胞产生的9个干扰素亚型的复合物 -C干扰素(a-consensus interferon)是通过筛选各种干扰素亚型，保留其相同的氨基酸，形成一致的分子结构，然后根据此序列合成DNA，再进行克隆产生,干扰素应用对象,HCV抗体阳性或HCV-RNA阳性的慢性肝炎患者 ALT升高在正常上限的1.5倍以上 无严重其他并发症及精神异常 治疗前一年内曾行肝穿刺检查,
