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1、临床PCR检验的质量保证,临床分子诊断发展历程：几个里程碑,1953年:DNA双股螺旋的发现 1963年:放射免疫测定技术、核酸测序方法 19721973年:重组DNA技术 1983年:PCR测定技术 1991-1993年:实时荧光PCR技术和芯片技术 2003年：人类基因组计划基本完成。纳米和量子标记技术？ 2011年-新一代测序技术,国内回顾,1990年：PCR技术在国内开始用于临床检测1990年代中期：假阳性？（假阴性？）,国内回顾,1996年：卫生部科研课题 1998年3月20日：临床PCR实验室管理专家咨询会（北京医院第一会议室） 1998年4月16日卫生部下发关于暂停临床基因扩增（
2、PCR）检验的通知（卫医发1998第9号）,国内回顾,1999年4月29-30日：基因扩增技术临床应用专家研讨会，针对临床开展PCR检验的问题，达成8点意见：（1）PCR技术本身没有问题，技术先进。（2）卫生部暂停临床应用有助于规范管理，应在严格管理的基础上适度开放。（3）限定临床开展PCR检验项目上。（4）加强对PCR实验室管理。（5）人员上岗培训。（6）应有室内质控和参加部中心室间质评。（7）SFDA尽管批准试剂文号。（8）成立专家咨询委员会。,1999年8月17-24日：第一期全国临床基因扩增实验室技术人员培训班在北京卫生部临床检验中心举办,2002年1月14日卫生部下发临床基因扩增检验
3、实验室管理暂行办法（卫医发200210号）,2002年7月28-29日深圳市人民医院检验医学部分子生物室通过验收,国内回顾,医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法 （卫办医政发2010194号） 医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则 （卫办医政发2010194号）,全国通过验收的临床基因扩增检验实验室,截止到2013年4月，全国按照所制定的标准通过验收的临床基因扩增检验实验室共1800余家。采用所编写的培训教材和培训模式共举办了培训班180多期，培训实验室技术人员16000多人。涉及全国30个省、直辖市和自治区。,质量保证 (Quality Assurance,QA),为一产品或服务满足特定
4、质量要求提供充分可信性所必要的有计划的和系统的措施。,室内质量控制（Internal Quality Control,IQC)的概念,由实验室工作人员，采取一定的方法和步骤，连续评价本实验室工作的可靠性程度，旨在监测和控制本实验室工作的精密度，提高本室常规工作中批内、批间样本检验的一致性，以确定测定结果是否可靠、可否发出报告的一项工作。 可概括为:(1)执行者：实验室技术人员；(2)目的：监测实验室测定的重复性；(3)功能：决定了当批测定的有效性，报告可否发出。是对实验室测定的即时性评价。,室间质量评价（External Quality Assessment, EQA）,为客观比较一实验室的测
5、定结果与靶值的差异，由外单位机构，采取一定的办法，连续、客观地评价实验室的结果，发现误差并校正结果，使各实验室之间的结果具有可比性。这是对实验室操作和实验方法的回顾性评价，而不是用来决定在实时的测定结果的可接受性。当EQA用来为执业许可或实验室认证的目的而评价实验室操作时，常描述为实验室能力验证（Proficiency testing, PT）。在以前的文献中，EQA常描述室间质量控制。,批 (Run),在相同条件下所获得的一组测定。（5个相同：地点、仪器、试剂、人员、时间 ）,正态分布(Gaussian distribution),当一质控物用同一方法在不同的时间重复多次测定，当测定数据足够
6、多时，如以横轴表示测定值，纵轴表示在大量测定中相应测定值的个数，则可得到一个两头低，中间高，中为所有测定值的均值，左右对称的“钟形”曲线，亦即正态分布，又称高斯分布。,正态分布的基本统计学含义可用均数（X)、标准差（SD)和概率来说明。,临床PCR检验实验室常规测定步骤,标本收集：选择测定项目、标本收集和保存。 实验室测定：标本接收、贴标签、样本处理、核酸扩增、产物检测、测定的有效性和临床诊疗价值。 报告和解释：结果发出、结果解释和临床管理。,质量保证、室内质控和室间质评之间的关系,临床标本的正确采集、运送、保存 的重要性,临床检验的质量保证关键性环节解决涉及实验室检验的医患纠纷的方法之一,标
7、本的类型,血清(浆) 分泌物 痰 粪便 尿 脑脊液 组织,标本采集、运送和保存中的关键点,容器：密闭的、一次性、无菌、无核酸酶及其他扩增抑制物 采集方法：人（训练有素）、防污染 运送保存时间和温度：尽可能快？低温？ 合格标本:容器完整、量够、时间符合要求、外观符合要求、要采到病原体,临床标本中PCR反应抑制物,内源性的 :免疫球蛋白、蛋白酶、血红素及其代谢产物、白细胞内的乳铁蛋白、肌红蛋白、脂类、粘蛋白、尿素、离子、胆盐、多糖等。外源性的 :如肝素抗凝剂、纤维素和硝酸纤维素、过度UV照射后的矿物油、手套滑石粉、标本容器或采样器材上含有的抑制物。,临床基因扩增检验的室内质量控制,测定前的质量控制
8、 非统计和统计学质量控制 质量控制的评价,测定前质量控制,实验室设施、仪器设备及管理理想的试剂和操作方法 人员培训,实验室设计,空间充分合理的空间良好的照明空调设备,临床标本的接收,通常的工作流程：标本采集 血清分离 编号 保存或检测 应在四个测定区域之外的地方或区域内接收 接收的标本应收集在原始容器中 在核酸提取时带入至标本制备区,理想的PCR实验室设计A,理想的PCR实验室设计B,临床PCR实验室设计的一般原则,各区独立 注意风向 因地制宜 方便工作,“十六字口诀”,(1)在物理空间上，必须是完全相互独立的，各区域无论是在空间还是在使用中，应始终处于完全的分隔状态; (2)不能有空气的直接
9、相通。,由清洁区域向污染区域流动,A,B,传递窗,传递窗,传递窗,“无基因”或“无核酸”概念的重要性！,尊敬的李教授：您好！来信请教一个问题，具体情况是这样的：我这儿使用的PCR仪是ABI 7300，用的是达安公司的HBV-DNA试剂，去年12月中旬的一次试验中发生了爆管事件，事件发生后，已经按照SOP规程进行了消毒处理，到现在已经有半年了，可还是不能消除污染。PCR实验室在三楼，现在即使加样操作放在同一幢楼房的一楼进行，其余如混匀、温育、离心等还放在原来的实验室，扩增也在原来的实验室，阴性对照孔所加对照都未如标本一样处理（因此暴露在空气中的时间很短），可是阴性对照孔仍有扩增，大约在21个循环
10、的时候开始，阴性对照显示的Ct约为26左右。请问这是什么原因，怎么处理才能消除污染。盼指点！,刘大夫：PCR实验室一旦出现严重污染，消除将会比较困难，通常可采用下述方法：（1）开窗通风;（2）采用次氯酸钠溶液擦地面及实验台面，甚至墙面;（3）增长紫外照射时间；（4）用75%乙醇空中喷雾，然后用于次氯酸钠溶液擦地面及实验台面。上述措施每天都要进行，直至污染消除。不知你是否按上述方法进行？如没有，你可以这样试，并请将效果告诉我。此外，在实验室出现严重污染后，如还要进行工作，则可临时更换一个厂家试剂，应就可以。,好吃懒做原来是病毒在作怪,2011年五大科学丑闻事件,The Scientist,实验室
11、仪器设备及管理,加样器：维护、校准 扩增仪：维护、校准 恒温干浴仪或水浴箱：维护、校准 离心机：维护 生物安全柜：维护 冰箱：维护,基因扩增仪器设备的质控,离心管、吸头等的质检,带滤芯吸头的密封性离心管PCR抑制物质检,扩增仪的扩增功能检测,目的：通过扩增功能来间接获知孔间的均一性。方法：即将加有一已知的含一定浓度的阳性质控样本的扩增反应管置于扩增仪各孔中按常规进行扩增检测，观察结果的一致性程度，如果有某一个或几个孔结果有问题，则应确定这一个或几个孔是否会重复性地得到假阴性结果，如果是，则表明相应孔的热传导有损坏。,理想的试剂和操作方法,试剂盒的质检 定量测定的精密度是测定组成步骤的变异和的平
12、方根(SD)=上式中SDa、SDb、SDc是步骤a、b、c等（例如试剂准备、标本采集、核酸提取、扩增和产物检测等）的标准差,理想的试剂和操作方法,改善测定精密度的措施必须首先着重在最不精密的步骤上，应对试剂准备、标本收集、核酸提取、测定方法和仪器操作写出“标准操作程序”(SOP),SOP等于试剂盒说明书吗？,SOP是实验室的“最高标准”！源于一些标准文件（如仪器试剂说明书、国际国内标准文件）和实验室实际工作经验积累。因此高于相关标准文件！,有可操作性的SOP是质量管理的“灵魂”！,质量管理的发展,经验管理 质量检验管理 统计质量管理 全面质量管理（ISO9000、17025、15189） 标准
13、化+全面质量管理,实验室质量管理体系的建立,质量手册质量体系程序文件标准操作程序(相关记录表格),实验室质量管理的内涵,写你所应做的 做你所写的 记录你已做的 分析你已做的,看得见的看不见的,好习惯是生产力 罗马不是一天建成的(Rome was not built in a day ) 任何事情只要能够坚持不断去加强它，它终究会变成一种习惯。,质量体系文件的三大特性,法规性、唯一性和适用性。 法规性:是指文件一旦制定完成并批准实施，就必须认真执行，按照相应的文件去完成日常检验工作，也就是前面所说的做你所写的。并且文件的修改不能随意，只能按规定的程序进行。 唯一性:则是指（1）一个实验室只能有一
14、个质量体系文件系统；（2）一项检验活动只能有唯一的操作程序；（3）一项规定只能有唯一的理解，不产生歧义；（4）只能使用文件的有效版本，无效版本在实验室的任何地方都不能使用。 适用性:是指质量体系文件无统一格式；无标准文本；怎么做怎么写，切合实际，具有可操作性，不拘一格。所有文件的规定均应保证在临床实际检测工作中能完全做到。当发现文件有不适合情况时，则应立即按规定程序对文件进行修改。,怎样编写SOP？,SOP （5W和1H）,谁来做(Who)： 责任人 做什么(What)：适用范围 何时（When）：适用范围 何地（Where）：适用范围 为什么做（Why）：目的 如何做（How）：操作步骤,“
15、文字”加“图片”的SOP能给我们带来什么？,仪器设备的维护和校准SOP,责任人 维护和校准的基本方面：光路、滤光片、波长、加热模块的清洁、具体的校准点选择（如加样器的校准体积点选择、温度计的校准温度点选择等）、维护和校准的具体方法包括用具 校准合格的判断标准 维护和校准的间隔时间,实验台面的清洁,实验记录表格的设计,存在问题,表格种类繁多 重复记录 表格无实用性，用于检查的痕迹很重,记录表格设计的基本原则,信息充分简单明了临床标本的检测信息能有机联系起来融入LIS系统？,临床PCR检验流程记录表检验日期 检验项目： 扩增仪中保存文件名： 使用说明： 1本记录表须严格遵循试剂准备区标本制备区扩增
16、区（产物分析区）单一流向移动，严禁逆向移动。 2各项工作执行后，在相应叙述前的“”内打“”。 3本记录表最后与相应的标本接收记录等归档保存于扩增区的专用文件柜内，以备查找。,实验前准备 试剂在有效期内 扩增仪、加样器和温度计在校准的有效期内 生物安全柜的滤膜在使用有效期内 消毒溶液在有效期内 冲眼器内无菌生理盐水在有效期内 离心管、带滤芯吸头已经过质检合格操作者：,试剂准备区（1区） 实验前 ： 打开通风设备 实验台面清洁（水或70%酒精擦拭） 冰箱温度：冷藏室（28） ； 冷冻室（182） 实验室温度： （允许范围：1030）；相对湿度： （允许范围：30%70%） PCR试剂来源： （可直
17、接列出有关厂家名称） 批号： 检验项目： 本次实验用量： 人份，剩余量： 人份。 其他有关试剂配制： 按XXX（将有关SOP编号列出）SOP配制1%含氯消毒液 毫升； 按XXX（将有关SOP编号列出）SOP配制4NaOH溶液 毫升； 按XXX（将有关SOP编号列出）SOP配制0.1%焦磷酸二乙酯 毫升； 按XXX（将有关SOP编号列出）SOP配制 毫升； 其他： 仪器设备使用： 离心机： 正常 不正常 振荡器： 正常 不正常 实验后： 按XXX（将有关SOP编号列出）SOP清洁实验室台面、地面、加样器和离心机，并进行紫外照射30分钟以上。 按XXX（将有关SOP编号列出）SOP处理实验废弃物。操作者：,
