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1、分子微生物学（表观遗传调控）表观遗传是指在染色体中DNA 序列不发生变化的情况下，基因表达却发生了可遗传的改变，这种改变在发育和细胞增殖过程中能稳定地遗传下去。表观遗传分子机制：DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑以及RNA干扰等DNA 甲基化DNA 甲基化是指由S 腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，在DNA 甲基转移酶(DNMTs) 作用下，基因组内CpG 二核苷酸中胞嘧啶的5 位碳原子被甲基化形成 5-甲基胞嘧啶。组蛋白修饰组蛋白作用：作为核小体的组成部件，为DNA 提供结合位点；调控转录的起始。组蛋白修饰：组蛋白在相关酶作用下在N-末端通过共价修饰作用发生甲基化、乙酰化、泛素化、 SUMO化和磷
2、酸化等翻译后修饰，进而形成丰富的组蛋白密码。组蛋白修饰 -乙酰化、甲基化高乙酰化状态以及H3K4甲基化 =euchromatin（真染色质）低乙酰化状态以及H3K9，H3K27甲基化 =Heterochromatin （异染色质）Promoter 范围内的 DNA 甲基化直接抑制转录组蛋白修饰 -泛 素 化、SUMO化泛素化： (ubiquitylation) 是介导蛋白质降解的重要方式之一，它通过将76 个氨基酸的泛素 (ubiquitin ，Ub）结合到靶蛋白上，形成多聚泛素链，被蛋白酶体识别，引起蛋白质降解; SUMO(small ubiquitin related modifier)
3、化：结构与泛素类似，在细胞内具有广泛功能，但并不介导蛋白酶体依赖的蛋白质降解过程表观修饰与真菌次生代谢产物的关系一、组蛋白甲基化与次生代谢组蛋白甲基化酶 : 复杂赖氨酸残基（ me, me2, me3）;精氨酸（ me, me2）LaeA CclA 一、组蛋白甲基化与次生代谢LaeA（组蛋白甲基转移酶）LaeA（组蛋白甲基转移酶）存在：丝状真菌（A terreus，Anidulans，Afumigatus ，AFlavus；Penicillium chrysogenum ） ，酵母中没有；全局调控因子（ global regulator） ：菌种形态；多种次生代谢产物；调控机理不清楚一、组蛋白
4、甲基化与次生代谢LaeA（组蛋白甲基转移酶）LaeA与 VeA，VelB形成复合体发挥转录调控作用；在光的作用下， VeA的核内转移被抑制，进而LaeA的作用被抑制；LaeA含有 SAM结合位点，甲基化酶类？Bok J W, Chiang YM ，Szewczyk E ，et alChromatin-level regulation of biosynthetic gene clustersNat Chem Biol ，2009，5(7)：462-464cclA 阻断突变株H3K4 的二甲基化和三甲基化显著降低，并伴随着H3K9的二甲基化和三甲基化降低。ccl 阻断突变株至少激活了2 条沉默基
5、因簇的表达，产生8 种新化合物，包括mondeictyphenone 、几种大黄素同系物、芳香聚酮 F9775A和 F9775B等。二、组蛋白乙酰化与次生代谢HdaA, HosB, HstA （组蛋白脱乙酰化酶）构巢曲霉：青霉素、norsolorinic acid 和 terrequinone A 。阻断 hosB (真菌特异的HOS3-like HDAC) 和 hstA (sirtuin 的同源体 )对真菌次级代谢没有显著的影响，而阻断hdaA(保守的class II HDAC) 后显著地提高norsolorinic acid 和青霉素的产量。同时失去这3 种 HDACs 的突变株的nors
6、olorinic acid 产量进一步提高。二、组蛋白乙酰化与次生代谢A. nidulans 与 streptomyces 共培养共培养外部刺激：Saga/Ada复合体（ HAT）促进 H3K9和 H3K14 的乙酰化；表观遗传修饰对次生代谢的影响化学表观遗传修饰对真菌次生代谢产物的影响化学表观遗传修饰对真菌次生代谢产物的影响How to regulate antibiotics (secondary metabolites) production? 2012 年国家自然科学基金面上项目化学表观遗传刺激对海洋真菌活性产物多样性的研究王立岩目的 1：如何发现更多的结构新颖的次生代谢产物（1）激活
7、沉默基因：a）改变培养基和培养方式；b）过表达次级代谢产物生合成途径特异性转录调控基因或全局调控基因；c）异源表达；（2）利用新菌种资源目的 2：利用化学表观遗传刺激剂为探针，深入探讨真菌次生代谢产物生物合成的调控机制Nancy Keller etal., 生物学手段研究化学现象，靶向性不明确；Cichewicz ，利用化学表观刺激物发现新化合物（=目的 1）Hertweck，偶像？利用化学指标为探针，深入探讨生物学问题！表一：化学表观遗传试剂（1）对 NO 产生抑制活性测定（2）对人结肠癌细胞细胞毒活性分子微生物学 -2- 红霉素的生物合成和组合生物合成从青霉素开始 组合生物合成的意义据估计
8、目前大概有105种的抗生素被发现, 但是只有 102种的抗生素被用于临床。原因：毒副作用、或者水溶性差、或者抑菌活性不高。以活性天然产物为母体进行化学结构修饰合成新的衍生物, 与从环境中随机筛选新的天然产物相比更具有针对性, 因此也成为目前新药发展的重要途径之一。组合生物合成解决化学合成难以解决的复杂结构修饰问题。如何去做？复杂天然产物的生物合成是从简单的小分子前体到终产物形成的多步骤反应。有特定的蛋白酶催化参与复杂天然产物生物合成的基因，通常特征性的成簇分布与微生物染色体的某一区域。红霉素是一类用于治疗革兰氏阳性细菌感染的广谱大环内酯类抗生素, 最早于 1952 年从红色糖多孢菌(Sacch
9、aropolyspora erythraea)的发酵产物里分离得到 。聚酮合成酶在目前发现的具有良好生物活性的天然产物中, 聚酮类化合物占据了很大的比例 . 这类化合物是以小分子羧酸为前体, 通过聚酮合酶(polyketide synthase, PKS) 催化合成的 . 根据催化模块是否重复利用以及功能域的不同, PKS 可分为 I 型、II 型和 III 型Post assembly line modifiucation 1、酰基转移酶AT 酰基转移酶AT 负责特异性识别底物, 替换识别不同底物的模块, 可以使不同的底物掺入内酯环的合成中。6-脱氧红霉内酯合成过程中6 个延伸模块的酰基转移
10、酶AT 都特异识别甲基丙二酸单酰辅酰A 为底物 ,将特异识别丙二酰辅酶A 的 AT 结构域分别替换模块 1 到模块 6 的 AT 结构域 , 将分别产生在内酯环C-12,C-10, C-8, C-6, C-4 和 C-2 位置缺少？红霉素结构类似物采用一个识别乙基丙二酰辅酶A 为底物的 AT功能域 (来自 Niddamycin 的PKS 模块 7)替换红霉素 PKS模块 5, 则可获得 C-6 位上的乙基取代类似物阿维菌素合成PKS 中起始模块的AT 具有广泛底物选择性的, 把后者的AT-ACP 区域替换原本红霉素合成PKS 所对应的区域后 , 杂合的 PKS 能够识别异丁酰辅酶A或者 2-甲
11、基丁酰辅酶A 为起始单元 , 合成 C-13 位上带异丙基或2-丁基的红霉素结构类似物许多 I 型 PKS 聚酮化合物如泰乐菌素(tylosin)、苦霉素 (pikromycin)、多杀菌素(spinosyn)等的起始模块AT-ACP 结构域的前端还含有KSQ功能域 . 这种结构单元的起始模块AT 首先识别的是二酸单酰辅酶A, 结合到酰基载体蛋白ACP后并不是直接转移到延伸模块的KS 结构域中 , 而是由其自身模块的酮基硫酯合成酶KSQ 结构域催化脱羧 , 再转移到第一个延伸模块的酮基硫酯合成酶 KS1 上进行下一步的合成。通过此种方式获得R1为甲基的产物2、红霉素 PKS 结构修饰功能域的改
12、变在 I 型 PKS 的某些模块组合有 -酮基还原酶 KR 、脱水酶 DH 和烯醇还原酶 ER 等功能域 , 这些功能域非PKS 催化反应往下延伸的必须基团, 但它们的存在会影响大环骨架上 -羰基的还原水平 . 对红霉素 PKS 延伸模块 6 中酮基还原酶KR 功能域和模块4 中烯醇还原酶 ER 功能域失活 , 可以得到相应的C-3 ？类似物27 和 C-6C-7 ？类似物28直接删除红霉素PKS 延伸模块 6 中酮基还原酶KR 结构域将影响与之相连的 AT 结构域的底物识别特异性, 结果除了产生化合物27 外, 还产生预料不到的化合物29对红霉素 PKS 唯一 DH(延伸模块 4)活性中心的
13、点突变, 将导致 DEBS 蛋白的完全失活在红霉素的PKS 中增加相关的功能域, 同样能产生红霉素的一些结构类似物 . 采用合成雷帕霉素PKS 延伸模块4 的 DH/KR 结构域分别替换红霉素PKS 延伸模块 2、模块 6 中的 KR 结构域 , 分别产生内酯环上含有烯键的化合物 30, 31.雷帕霉素 PKS 中的延伸模块1 的 DH/ER/KR 结构域分别替换红霉素PKS 延伸模块 2、模块 5 中的 KR 结构域则产生内酯环脱羟基的化合物？采用此结构域替换红霉素PKS 延伸模块 6 时, 并未发现脱羟基化合物34 出现 , 反而有较 多的化合物 27 和 31 积累，说明？组合生物合成在
14、扩展天然产物结构多样性方面的巨大潜力通过对各种聚酮类的结构域或模块互相组合, 分别得到多种组合突变的重组子 , 表达得到近 60 种 6-脱氧红霉内酯类似物库. 占当时已知的所有聚酮化合物数量的3%, 超过之前自然界所发现的不同大环内酯环结构的总量. 这些复杂的结构类似物采用化学合成的方法都是很难获得的. 3、内酯环单元数的改变TE：负责将合成的长链脂肪酸从PKS 上水解下来 , 并与 PKS 的其它部位共同作用 , 将产物环化成一个十四元环的化合物6-脱氧红霉内酯。TE 对聚酮链的长度有较高的容忍性,能够识别环化不同数目碳链原子形成数目不同元环 . KR 功能域属于一类短链还原酶(short
15、-chain dehydrogenase/reductase,SDR)家族的酶系催化产生R 构型化合物的KR 活性中心一侧含有一个高度保守的天冬氨酸残基还原产生S 构型化合物的KR 活性中心则缺少此天冬氨酸残基, 但在活性中心相反的一侧含有一个色氨酸残基. 这些活性中心结构上细微差异使聚酮类化合物(底物 )进入 KR 活性中心时的方向不同 , 从而最终使还原产物形成不同的立体构型。把合成雷帕霉素rapamycin PKS 模块 2 或模块 5 插入到红霉素PKS延伸模块 1 后面后 , 能够产生 16 元环化合物 38, 39 及在 C-13 位环化的十四元环产物 40, 414、后修饰途径过
16、程中的组合生物合成红霉素合成后修饰途径组合生物合成中最感兴趣的是内酯环的糖基化。这些糖基是红霉素生物活性的关键所在。糖基转移酶EryCIII 催化 C-5 羟基上的糖基化 , 有较高的底物特异性. 但目前仍然有报道显示EryCIII 能够把 D-mycaminose 转移到内酯环的C-5羟基上从而形成新的红霉素类似物红霉素M (53)与红霉素结构非常相似的另外一个天然产物苦霉素picromycin C-5 羟基的德胺糖转移酶对底物的容忍性也比较宽泛, 能够识别一系列6-脱氧红霉内酯的结构类似物 . 问题与展望应 用组合 生物合成可以改变抗生素原有的生物合成过程，使其结构多样化，而这一点通过化学方法是很难甚至是无法达到的。这方面的进一步研究将有助于理解医学上的一些重要二级代谢产物的结构和功能的关系。随着这一研究方法的不断发展，人们将能够合成更多抗酸且对耐药性致病菌具有活性的新的红霉素类物质，从而使更安全、更有效的药物不断出现。问题与展望实际操作过程中新化合物能否被催化合成取决于酶对于底物的容忍性. 绝大多数经过组合生物合成手段合成的结构类似物产量要比原始的天然
