维生物工程实验(1)

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1、第一部分微生物工程实验实验一紫外线诱变育种一、实验目的学习并掌握紫外线诱变育种的原理及操作方法。二、实验原理紫外线是一种最常用的物理诱变因素，它的主要作用是使DNA 双链间或同一条链上两个相邻的胸腺嘧啶形成二聚体，阻碍双链的分开、 复制和碱基的正常配对，从而引起突变。紫外线照射引起的DNA 损伤，可由光复活酶的作用进行修复，使胸腺嘧啶二聚体解开恢复原状。因此，为了避免光复活， 用紫外线照射处理时以及处理后的操作应在红光下进行，并且将照射处理后的微生物放在暗处培养。紫外线诱变一般采用15 W 紫外线杀菌灯， 波长为 2537 A。灯与处理物的距离为 1530 cm，照射时间依菌种而异，一般为几秒

2、至几十分钟。紫外线的剂量若灯的功率为 30 W，距离为 30 cm 时，每平方毫米每秒为53 10-7 J。一般我们常以细胞死亡率表示。例如，我们希望照射的剂量死亡率控制在7080为宜。被照射的菌悬液细胞数， 细菌为 108个/ml 左右， 霉菌孢子和酵母细胞为106107个/ml。由于紫外线穿透力不强，要求照射液不要太深，约0.51.0 cm 厚，同时要用电磁搅拌器或手工进行搅拌，使照射均匀。三、实验器材115 W 紫外灯。2磁力搅拌器。3摇床（或恒温振荡器） 。4漏斗、三角瓶、玻璃珠等。四、实验材料1菌种大肠杆菌（或枯草杆菌），在肉汁蛋白胨培养液中摇瓶培养1820 h。2培养基牛肉膏蛋白胨

3、固体和液体培养基。3无菌生理盐水。五、操作步骤1将细菌培养液以 3000 r/min 离心 5 min，倾去上清夜，将菌体打散加入无菌生理盐水再离心洗涤。2将菌悬液放入一已灭菌的、装有玻璃珠的三角瓶内用手摇动，以打散菌体。将菌液倒入有定性滤纸的漏斗内过滤，单细胞滤液装入试管内， 一般处于浑浊态的细胞液含细胞数可达108个/ml左右，作为待处理菌悬液。3取 24 ml 制备的菌液加到直径9 cm 培养皿内，放入一无菌磁力搅拌器，然后置磁力搅拌器上， 15 W 紫外线下 30 cm 处。在正式照射前，应先开启紫外线 10 min，让紫外灯预热，然后开启皿盖正式在搅拌下照射1050 s。操作均应在红

4、灯下进行，或外用黑纸包住，避免白炽光。4取未照射的制备菌液和照射菌液各0.5 ml 进行稀释分离，计数活菌细胞数。5取照射菌液 2 ml 于液体培养基中（ 300 ml三角瓶内装 30 ml 培养液） ，120 r/min 振荡培养 46 h。6取中间培养液稀释分离、培养。六、结果处理死亡率（）（未照射菌液菌数 /ml-照射菌液菌数 /ml）/ （未照射菌液菌数 /ml） 100 实验二葡萄酒（饮料）的制备一、实验目的1. 掌握巩固酵母菌乙醇发酵的生化途径2. 学习葡萄酒的酿造方法二、实验原理酵母菌在厌氧的条件下，可以将葡萄中的葡萄糖转化为乙醇和二氧化碳，葡萄酒品种繁多，一般按颜色，糖份多少，

5、有没有添加白兰地或酒精，含不含CO2或酒的产地来分类。红葡萄酒是用带色果皮制成，含有果皮或果肉中的有色物质，酒色深红， 鲜红或红宝石色。干红葡萄酒含酒精913。白葡萄酒是用白葡萄或红葡萄的果汁制成，色泽淡黄或金黄色。 酒精一般为913。葡萄酒发酵可以采用天然发酵和纯发酵两种方法。三、实验器材棉塞三角瓶（ 1 L） ，大漏斗（直径 15 cm）蒸锅，调羹，纱布，牛皮纸，杆秤，温度计，糖度计（ 030） ，pH 试纸，培养箱。四、实验材料1菌种葡萄酒酵母。1白葡萄酒用一般糖度的白葡萄，红葡萄酒用红黑色葡萄，砂糖。五、操作步骤1 流程 原料葡萄 除梗压榨葡萄汁 砂糖混合发酵原液 注入三角瓶湿热灭菌

6、放凉加酵母 发酵过滤成品。2原料的调制及发酵原液的调制同一般果汁的制法相同， 但红葡萄酒不除种子及皮。对 1 L 三角瓶，需备红葡萄700 g 或白葡萄 1000 g。葡萄汁加砂糖调整糖度至发酵原汁。其计算方法如下：设果实原糖度为 d %，总量为 Gkg,现要配制 24 %(g %)的发酵原汁，需加糖若干 g(x) G d %+x/(G+x)=24/100(或 d/100) 3将发酵原汁加入三角瓶达容器高度的1/2 为宜。4灭菌塞上棉塞，上包牛皮纸，60 灭菌 20 min，凉至 30 ，加入纯培养菌 20-100 mL 左右。若进行自然发酵，则无须灭菌。5. 发酵与管理2830 恒温培养发酵

7、， 每天振一次， 不宜过多。主发酵约 710 天，发酵停止后过滤。 再进入后发酵， 后发酵期间过滤23 次，即得澄清液。实验三补料培养实验一、实验目的学习并掌握补料培养意义及操作方法。二、实验原理补加含有不同浓度的葡萄糖与酵母膏的料液对大肠杆菌菌体量有显著影响，补料液中的葡萄糖与酵母膏的比例可设为6：1（质量比），5：1 或 4：1 三、实验器材.摇床三角瓶培养皿玻棒高压蒸汽灭菌器四、实验材料大肠杆菌蛋白胨酵母膏葡萄糖琼脂 CaCO3 MgSO4.7H2O K2HPO4 MnSO4五、操作步骤1. 材料和方法（1）材料 菌株：大肠杆菌。（2）培养基斜面培养基（ g/L） ：蛋白胨 10.0，酵

8、母膏 3.0，葡萄糖 2.0，琼脂 2.0，用自来水定容至一升， PH7.0-7.2。种子培养基 （g/L） ：蛋白胨 10.0，酵母膏 10.0，葡萄糖 20.0，MgSO4.7H2O 0.5，CaCO3 10.0，PH 7.0-7.4。发酵培养基（ g/L） ：蛋白胨 10.0，酵母膏 10.0，葡萄糖 6.0，MgSO4.7H2O 1.0,K2HPO4 2.0，MnSO4 0.45 10-3，PH 7.0。2. 培养方法（1） 种子摇瓶培养取1ml斜面种子菌悬液接入装有40ml 种子培养基的 250 ml三角瓶中， 40 C，140 r/min，培养 20 h。（2） 摇瓶发酵培养以 5

9、%的接种量将种子接入装有50 ml发酵培养基的 250 ml三角瓶中， 40 C，140 r/min，培养 72 h。（3）摇瓶发酵分批补料培养以 5%的接种量将种子接入装有40ml 发酵培养基的 250 ml 三角瓶中， 40 C，140 r/min，培养 8 h后进行补料，补料期间控制PH 在 7.0 左右补料分 2 次，补料液共 10ml，培养至 20 h 停止补料，继续培养至72 h发酵结束。3. 分析方法细胞总数测定采用倾注法活菌计数实验四5L 发酵罐进行细菌 （大肠杆菌或苏云金芽孢杆菌）的增殖培养实验一、实验目的1. 熟悉发酵罐的结构2. 掌握利用发酵罐培养大肠杆菌的原理和方法二、

10、实验原理微生物的发酵培养方法有静置培养、通气搅拌培养等， 以 5 L 发酵罐进行通气搅拌培养可大量生产菌体及发酵产物；能在很大范围内调节氧气供给速度；pH 控制及消泡装置的连续操作较容易；能在同一容器采样，因而易于跟踪培养过程中各参数随时间的变化。所用的菌种为Escherichia coli。三、实验器材发酵罐四、实验材料大肠杆菌葡萄糖（NH4）2HPO4 NaCL MgSO4.7H2O K2SO4 微量元素液CaCl2.2H2O 蛋白胨牛肉膏酵母膏五、操作步骤（1）培养系统的配置发酵罐中配置用于供给冷却水，循环水及通向排水口的管子。如用自来水， 考虑到自来水的水压在夜间会上升，应用比较耐压的

11、软管， 连接的部位用紧固件等充分固定。另外必须使用内径与所要连接的软管口及自来水龙头相吻合的软管。在发酵罐中配备压缩空气供给用的配管。通常从空气压缩机出来的气压比较高，因而更要注意使用充分耐压的管子。（2） 种子培养种子培养时用种子培养基。培养条件如下：时间， 12.0 h； 初始 pH， 7.0 ； 温度， 30.0 ； 500 ml三角瓶中装入 150 ml 的培养基。按肉汁培养基的成分配制培养基，每只三角瓶分装 150 ml， 然后在高压灭菌锅内 120 下灭菌 20 min。 接种于种子培养基的菌种保存于斜面中，每个三角瓶接一环。发酵罐中接种量为工作体积的5，与此同时，种子培养过程必需

12、准备最低限度体积的种子，以确保接种量。（3）清洗 在发酵罐进行培养前后都应进行清洗，特别是在前后使用不同的菌种时，更应充分清洗及灭菌。 发酵罐有各种部件， 即使有一小部分没清洗干净，也会产生杂菌污染， 因此必须彻底清洗干净。 据以往经验来看， 杂菌污染的主要原因是清洗不彻底以及种子培养时就污染了杂菌。经常容易忘记清洗的是空气分布器内部和采样管内部， 以及顶板上放零件的小间隙等，这些地方应特别注意。 另外， 发酵罐的周围、加热器以及电动机等使用电的部位有时会因为漏水造成故障，所以应将发酵罐外壁、顶板及底板的外表面擦干。（4）预杀菌用三角瓶进行种子培养的过程中，可以同时对发酵罐进行预杀菌，防止杂菌

13、污染，而且操作人员对培养操作要熟练。在连接分布器的部分， 用硅胶管连接好过滤器， 用螺旋阀关上玻璃管， 以防止杀菌结束时培养基通过分布器时发生倒流以及灭菌后从过滤器中漏出。如果过滤器与分布器之间已有截止阀，就无需再用螺旋阀关闭。 在过滤器的另一端， 顶端塞上棉花，用牛皮纸包好，使用橡皮圈连接上固定好的长56 cm的硅胶管。在排气管上装配同样塞入510 cm 棉花的玻璃管，使蒸气能自由出入发酵罐内，而杂菌却无法进入。取样管上安装硅胶管， 接上采样用的连接管， 弯曲的硅胶管的中间部分用螺旋阀关闭，以避免杀菌时培养基通过管路溢出。发酵罐中放入占总体积70的水， 取出发酵罐体并放入高压灭菌器内进行预灭

14、菌。通常在 120 下灭菌 20 min。灭菌结束后， 冷却至常温，倒掉发酵罐内的水，准备进行正式灭菌。（5）发酵罐培养A 培养条件初始 pH 7.0；温度：30.0 ；初始工作体积： 2 L；发酵罐体积： 5 L。将培养基各组分分别溶解在蒸馏水中， 放入发酵罐中灭菌， 培养基是肉汁培养基，120下灭菌 30 min B 正式灭菌把培养基放入发酵罐，准备好电极和管子，将一端浸入发酵罐中的取样管用节流夹关闭， 以避免培养液漏出。 如管子太粗， 很难装上节流夹， 这时可以用螺旋阀。 正式灭菌与预灭菌一样， 将准备好的发酵罐放入高压灭菌锅内进行灭菌。 灭菌前，应检查排气管的一端是否已在螺旋阀上连接棉

15、栓，以及是否以及安装了防水罩。 灭菌时，排气管起保持发酵罐内外均压的作用，因此不能用节流夹将之关闭。C 接种前的准备当高压灭菌锅的温度降到60 以下时，打开盖子，检查里面的管子等是否偏移， 然后从灭菌锅内取出发酵罐进行安装操作。迅速接上进气阀管路，检查排气管路是否已充分开放。待充分开放后， 通气至 0.30.5 L/min。接上冷却水的管路， 打开冷却水， 接上电源低转速搅拌使培养液冷却，注意冷却时间不能太长。使用温度调节装置D 接种操作在发酵罐顶板的接种口进行。降低通气量，接着在接种口周围塞上脱脂棉以储存酒精， 注入少量酒精点火后移开接种口盖子，在火焰中迅速进行其他灭菌培养基的加入以及接种操

16、作。接种完成后， 立即用火婄烧接种口盖子的内侧，盖上，拧紧，使搅拌转速和通气量回到正常值，开始进行发酵罐培养。E 培养开始时应注意的问题培养开始后几个小时是最易发生故障的时间段，因此应检查一下， 尽量使发酵罐及其周围的装置运转正常。在刚开始后就取样处理的时候，应尽量不停止对发酵罐的监控。特别应注意ph、温度、发泡等。F 发酵过程中应注意的问题在培养的过程中故障的发生率比刚开始培养时低，这时应注意夜间漏水以及管子所引起的阻塞。尤其在细胞增殖和产物合成的高峰期，因为那时发泡比较剧烈。每次采样时最好进行上述检查。（6）发酵结束时的操作发酵结束后， 将发酵液取出进行灭菌。 这时可以装着各种电极，将残留的培养液倒弃至特定的地方。培养液会因为温度较高而产生恶臭， 应充分冷却后再倒掉，清洗按照前述清洗步骤进行。（7）采样及分析方法培养开始后约 3 h 左右，应立即采样，采样操作首先在取样管上接一个注射器，弃去初放出的15 mL 发酵