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1、常用的染色方法,主要内容,瑞氏染色法 网织红细胞染色方法 革兰染色法 抗酸染色法,2,瑞氏染色法,一、概述：瑞氏染色法是目前最常用的血涂片染色方法。其染料由酸性伊红和碱性美蓝组成，美蓝和伊红的水溶液混合后，产生一种不溶于水的伊红化美蓝中性沉淀（ME），即瑞氏染料。将适量的ME溶解于甲醇中，即成为瑞氏染液。,3,瑞氏染色法,二、细胞着色原理：既有物理的吸附作用，又有化学的亲和作用。各种细胞成分化学性质不同，对各种染料的亲和力也不一样。如血红蛋白、嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结合，染粉红色，称为嗜酸性物质；细胞核蛋白、淋巴细胞、嗜碱性粒细胞胞质为酸性，与碱性染料美蓝或天青结合，染紫蓝色或
2、蓝色，称为嗜碱性物质；中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染淡紫红色，称为嗜中性物质、原始红细胞、早幼红细胞胞质、核仁含较多酸性物质，染成较浓厚的蓝色；中幼红细胞既含酸性物质，又含碱性物质，染成红蓝色或灰红色；完全成熟红细胞，酸性物质彻底消失后，染成粉红色。,4,瑞氏染色法,三、操作：1. 制作血液或脱落细胞涂片，自然干燥固定；2. 用蜡笔在血膜两头划线，滴加瑞氏染液35滴以覆盖整个血膜，固定12分钟；滴加等量或稍多的缓冲液（未加缓冲液涂片上有染料颗粒残留），吸球吹匀或摇动玻片染色510分钟；3. 用流动水从玻片的一侧冲去染液，自然干燥（或滤纸吸干）；4. 镜检。,5,瑞氏染色法,四、注意
3、事项：1、PH对细胞染色有影响。由于细胞中各种蛋白质均为两性电解质，所带电荷随溶液PH值而定。在酸性环境中正电荷增多，已与酸性伊红结合，染色偏红；相反，则易与美蓝结合，染色偏蓝。因此，应使用清洁中性的载玻片，稀释染液必须用PH6.8缓冲液。冲洗玻片必须用流水。2、染色的时间与染液浓度、染色时温度成反比；而与细胞数量成正比。3、冲洗时不能先倒掉染液，应用流水冲去，以防染料沉淀在血膜上。4、如血膜上有染料颗粒沉积，可加少许甲醇溶解，但需立即用水冲掉甲醇，以免脱色。,6,瑞氏染色法,5、染色过淡，可以复染。复染时应先加缓冲液，创造良好的染色环境，而后加染液，或加染液与缓冲液的混合液，不可先加染液。6
4、、染色过深可用水冲洗或浸泡水中一定时间，也可用甲醇脱色。7、染色偏酸或偏碱时，均应更换缓冲液再重染。8、瑞氏染液的质量好坏除了用血涂片实际染色效果评价外，还可采用吸光度比值RA评价。瑞氏染液的成熟指数以RA（A650nm/A525nm）=1.30.1为宜。,7,8,中性杆状核粒细胞,中性分叶核粒细胞,嗜酸性粒细胞,嗜碱性粒细胞,单核细胞,淋巴细胞,网织红细胞染色方法,一、概述：根据网织红细胞的形态特征和成熟程度将其分为五型：花冠型、丝球型、网型、破网型、点粒型。网织红细胞经体外活体染色后，显微镜下凡含有两个以上的深染颗粒或具有线网状结构的无核红细胞，即为网织红细胞。WHO推荐使用新亚甲蓝染色液
5、，因其对网织红细胞染色力强且稳定而被首推。,9,网织红细胞染色方法,二、操作：1、取小试管一支，加入新亚甲蓝染液2滴。2、加入末梢血或EDTA抗凝静脉血2滴于上述试管中，混匀。3、室温下放置15min后，取1滴制成薄片。4、油镜下至少计数1000个红细胞中网织红细胞数量。5、计算：网织红细胞百分数=计数1000个红细胞中的网织红细胞数/1000；网织红细胞绝对数（个/L）=网织红细胞百分数*红细胞数/L,10,网织红细胞染色方法,三、注意事项：1、活体染色时间不能过短。室温低时，放37恒温箱。2、最好制两张片，每张计数1000个红细胞，避免分布不均引起的误差，涂片要薄而均匀，不使红细胞重叠。3
6、、为计数方便，可于目镜中放一中间有孔硬纸片或用Miller窥盘，缩小视野便于计数。4、用瑞氏或瑞氏-吉姆萨染液复染后，可使网织红细胞计数结果减少。5、染液与血液比约为1：1，严重贫血时可适量增加血液的比例。,11,Miller窥盘法,由于目测计数误差较大,用Miller窥盘法可减低标准误,特别是RBC较少时. 盘:厚1mm,直径19mm,圆玻片上划出格子:大方格内Ret/(小方格内RBCx9)X100%,13,网织红细胞,革兰染色法,一、基本原理：革兰染色是细菌最基本的染色法，可用于标本涂片或菌落涂片。细菌的等电点较低，约在PH2-5，一般情况下细菌带负电荷，易于被带正电荷的碱性染料（结晶紫，
7、碱性复红）着色。染色结果将细菌分为革兰阳性（紫色）和革兰阴性（红色）两类。,14,革兰染色法,二、方法：涂片干燥固定染色过程如下：1、涂片经火焰固定后，加结晶紫液染1min，清水冲去染液，倒去玻片上水。2、加碘液染1min，水洗。3、加脱色液（95%乙醇），不使摇动10-30s，至无紫色脱落为止，水洗。4、加复染液（碱性复红液），染30s，水洗。5、干后镜检。,15,革兰染色法,三、注意事项：1、涂片：菌液涂片时，用接种环蘸取菌液直接在玻片上涂布；若是菌落，先取生理盐水1滴，置于玻片上，用接种针挑取菌落，在盐水中涂布。2、干燥：制备的涂片应自然干燥。3、固定：多采用加热固定，目的在于保持细胞原
8、有的形态和结构，杀死细菌，使染料易于着色，并是细菌附着于玻片上不易脱落。自然冷却后在染色。4、革兰氏染色成败的关键是脱色时间，如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而被误认为是革兰氏阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被误认为是革兰氏阳性菌。因此必须严格把握脱色时间。,16,17,G-菌,G+菌,抗酸染色法,一、基本原理：分枝杆菌的细胞壁内含有大量的脂质，主要是分枝菌酸，它包围在肽聚糖的外面，所以分枝杆菌一般不易着色，要经过加热和延长染色时间来促使其着色。但分枝杆菌中的分枝菌酸与染料结合后，就很难被酸性脱色剂脱色，故名抗酸染色。齐-尼氏抗酸染色法是在加热条件下使分枝菌酸与石炭酸复红牢固结合成复合物，用盐酸酒精处理也不脱色。当再加碱性美兰复染后，分枝杆菌仍然为红色，而其他细菌及背景中的物质为兰色。,18,抗酸染色法,二、方法：1、涂片经火焰固定后，加石炭酸复红溶液2-3滴，徐徐加热至有蒸汽出现，切不可沸腾。染5min，冷却后水洗。2、加脱色剂（3%盐酸酒精）30s-1min，不时摇动玻片至红色脱落为止，水洗。3、加复染液（碱性美兰溶液），染0.5-1min，水洗。4、干后镜检。,19,抗酸染色法,三、注意事项：1、抗酸染色直接用于痰标本时，可以适当增加标本涂片的厚度，以提高检出率。2、涂片厚度要适中。3、初染加热的温度，勿沸腾。,20,21,22,谢谢,
