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1、肝移植相关基础研究,中国活体肝脏移植研究所 南京医科大学第一附属医院肝脏移植中心,俞 悦,临床背景 2. 国内外研究现状,临床背景 国内外研究现状,第一部分,全肝移植,1963年，Starzl 完成人类首例同种异体肝移植 1983年，美国NIH确定肝移植为终末期肝病的有效治疗手段 全球每年10000余例，累计完成16万例左右,肝移植历史和现状,我国现状,我国的肝移植起步于1977 年，由于供体缺乏、预后不佳等多种原因，停滞了较长一段时间。 近几年，肝移植出现了全国性的大发展。中国每年约1500例，迄今总例数约10000-15000例。,面临问题,移植肝损伤免疫排斥反应肝癌或肝炎肝移植后疾病复发
2、供体缺乏,肝移植物损伤机制,炎症损伤,移植物失功能,氧化应激,微循环,缺血再灌注损伤,保存液开发 缩短冷热缺血时间,移植前,移植中,移植后,免疫排斥,保存损伤,抑制炎症 改善微循环,保存液的自主开发,ZW液对大鼠移植肝缺血再灌注的保护及器官冷保存的应用研究,采用的ZW液含有植物药物，如川芎嗪、山莨菪碱、丹参、苦参碱、苦黄等。上述药物将都具有抗炎抗氧化保肝的作用，它们均作为药物的单体成分，其化学结构、药代、药效和药理作用机制明确，副作用很小，并已制备出多种剂型供临床选用 。,个体差异。 常用的免疫抑制剂都是供体抗原非特异性的。抑制肝癌、肝炎肝移植后疾病复发诱导供体抗原特异性的免疫耐受,免疫抑制剂
3、的应用,HBV infection,Chronic HBV,Cirrhosis,Hepatic Failure,Liver Cancer,Liver Transplant Candidates,20%, 20%,20%-50%,HBV: Disease Progression,Time: 20-30 years,肝移植术后肿瘤、乙肝复发,肝移植术后肿瘤、乙肝复发,免疫抑制剂的应用，是否诱导肿瘤与病毒复发,诱导特异性的免疫耐受,转座元介导的人IL-10基因抗大鼠肝移植排斥反应转FasL基因的树突状细胞诱导大鼠肝移植免疫耐受 腺病毒载体介导的CTLA4Ig表达对大鼠肝移植免疫的抑制导入MHC基因的
4、自体骨髓细胞输注诱导猪肝移植免疫耐受雷公腾多甙对大鼠肝移植急性排斥反应的影响,CD4+CD25+调节性T细胞抗大鼠肝移植急性排斥反应,Adoptive transfusion of donor alloantigen activated CD4+CD25+ regulatory T cell in the rejection of DA-LEW liver transplantation. Surgery,建立DA-LEW大鼠急排模型,CD4+CD25+Treg分离、激活,Foxp3基因CD4+CD25+Treg功能研究,CD4+CD25+调节性T细胞体外扩增,观察排斥指标,拓展供肝来源,老年
5、供肝、脂肪肝供肝等边缘性供肝活体供肝,第二部分,活体肝移植,美 国,每年尸体供肝约4000例,实际等待供肝者超过20000例,供肝严重短缺！拓宽供肝来源，大势所趋！,平均等待时间超过600天，等待期死亡率20%-25%,中国每年需要肝移植的终末期肝病超过10万例,中国每年实际肝移植病例数不足2000例,中 国,减体积肝移植 劈离式肝移植 活体肝移植 （Living Donor Liver Transplantation, LDLT) 上述术式肝移植的供肝都是小移植肝！,解决全球性供肝来源匮乏有效途径,广义上说，活体移植肝体积远低于正常肝脏，在理论上，LDLT的移植物都是小移植肝 最常用评价方法
6、：移植物与受者体重比（GRWR）；供肝体积（GV）和标准肝体积（SLV）之比 （GV/SLV） 目前，学术界认为临床上，小移植肝是指GRWR0.8%的移植物；动物实验中，小移植肝是指GV/SLV小于50的移植肝,什么是小移植肝？,中国活体肝移植工作的开始,1995年1月，本组（南京医科大学第一附属医院肝脏移植中心）完成国内首例活体肝移植。,LDLT目前存在的问题,外科技术 移植物体积过小 再生特点 免疫学特点 HCC受者肿瘤复发 乙肝复发成人活体肝移植应用日趋广泛，全球已报道供肝者死亡达14例，供者面临更大风险，供肝体积受到更严格限制 小移植肝综合症已成为影响活体肝移植术后受体预后的关键原因,
7、小肝综合征：术后持续性胆汁淤积， 凝血机制紊乱，门静脉高压，大量腹水，肝功能恢复延迟,小移植肝基础研究的目标是：最大限度保障供肝者安全，获取供肝者最小量供肝，并同时满足受者生理需要（即获取最小有效供肝量）,小移植肝基础研究的目标,20世纪90年代中期（1995年）以后，随着部分肝移植深入开展，小移植肝损伤机制与保护措施的基础研究逐渐成为国际器官移植领域的热点课题 小移植肝损伤机制复杂，国际上研究时间短，10余年历史,文献少，很多环节尚不清楚 根据小移植肝损伤机制，探索符合临床实践的小移植肝保护措施，是这一领域研究重点 集中于日本、香港、美国、韩国、中国南京等少数中心 2005年4月，国家卫生部
8、批准在南京成立卫生部活体肝脏移植重点实验室，重点研究方向是临床活体肝移植和小移植肝基础研究,小移植肝基础研究国内外现状,小体积肝移植物损伤机制与再生特点,炎症损伤,功能维持,氧化应激,微循环,缺血再灌注损伤,移植前,移植中,移植后,免疫排斥,保存损伤,门脉高灌注,肝再生,降低门脉压力 抑制炎症 改善微循环,主要研究内容,研究内容之一：小移植肝动物模型的建立和相关研究,建立大鼠小移植肝模型 对不同体积小移植肝功能状况对照研究 吻合肝动脉大鼠小移植肝模型,三种体积肝移植术后移植物内AST 水平变化比较,三种体积肝移植术后移植物内IL-6水平变化比较,三种体积肝移植术后2h、24h病理变化比较,移植
9、肝体积越小，门静脉和肝动脉灌注压力越高,组织损伤越重，对肝功能影响越大,肝动脉吻合可显著改善大鼠小移植肝功能，减轻组织学损伤，促进肝再生 吻合肝动脉的小移植肝模型更加符合活体肝移植临床实际，为小移植肝基础研究提供良好载体,全肝组,30%小肝组,50%小肝组,术后24h, Cyclin D1,术后24h, PCNA,小移植肝术后再生强烈，可能与肝再生信号通路的激活有关,研究内容之二：缺血预处理对大鼠小移植肝再生的影响及相关机制研究,缺血预处理对大鼠不同体积小移植肝术后肝再生的影响,通常认为,缺血预处理对移植物有保护作用。 对于30%小肝移植物，缺血预处理明显加重损伤，抑制了肝再生,机制是降低肝内
10、细胞因子水平，抑制细胞周期相关蛋白表达,研究内容之三：腺苷A2A受体对小移植肝缺血再灌注损伤保护作用及其机制的研究,小移植肝缺血再灌注损伤机制研究 A2A受体对小移植肝缺血再灌注后,氧化应激反应作用、炎性反应作用、细胞凋亡作用研究,A2A受体激活，可减轻小肝移植术后氧化应激反应,减少小移植肝内炎性因子的表达,A2A受体激活可降低小移植肝细胞凋亡，维持肝脏组织正常结构,可改善受体生存率,减体积肝移植大鼠的生存率低 移植早期肝细胞再生能力受损 移植后“小移植物综合征”（SFSS)损伤机理门静脉高灌注缺血再灌注损伤移植早期肝细胞的快速再生以及移植后肝功能支持是必须的。,研究内容之四：表达肝细胞生长因
11、子的骨髓间充质干细胞保护大鼠小肝移植物的研究,立论依据,肝细胞生长因子（Hepatocyte growth factor, HGF）,HGF具有促有丝分裂和细胞保护作用 HGF是最强的促肝细胞再生剂 HGF应用广泛 HGF的致命弱点：半衰期小于15min 解决方法：转基因,间充质干细胞（Mesenchymal stem cells, MSCs）,MSCs为中胚层发育的早期细胞，具有多向分化潜能，可分化为肝细胞。 骨髓干细胞由于其取材方便，而成为研究的热点。 易于携带和表达外源基因。,研究内容之四：表达肝细胞生长因子的骨髓间充质干细胞保护大鼠小肝移植物的研究,构建腺病毒载体重组子，体外感染骨髓间
12、充质干细胞，获得稳定表达人HGF的HGF/MSCs,HGF/MSCs移植后，实验组大鼠肝功能改善，肝再生加快，受体生存率提高,GFP+Alb,GFP,转基因间充质干细胞改善小移植肝生存率的可能机制 1、早期通过HGF的作用，促进肝再生，提高生存率； 2、后期通过MSCs与HGF的协同作用，降低炎性反应，保持肝脏正常结构，预防移植肝纤维化,小结,1、在国内率先建立吻合肝动脉小移植肝模型，提供了较为符合活体肝移植临床实际的研究载体 2、采用选择性腺苷A2A受体激活剂，具有简单易操作的特点，显著减轻小移植肝损伤，为小移植肝保护措施的临床应用提供了切实可行的途径,小结,3、通常认为，缺血预处理具有保护
13、移植物作用。本组在国际上首次提出，当移植肝体积小于30%时，缺血预处理可能会加重移植肝损伤。同时探讨基因转导和T调节细胞输注等多途径干预对小移植肝的影响。 4、在国际上首次将转肝细胞生长因子（HGF）基因的骨髓间充质干细胞移植应用于小移植肝保护，有效延长了小移植肝生存时间，为干细胞移植在小移植肝保护中的应用提供了新思路,成果发表于Molecular Therapy、 Surgery、 Transpl Int、Transpl Immunol国际著名SCI期刊，与香港、日本、欧美等国际上著名中心同类研究水平相近，达国际领先,干细胞在肝脏疾病领域的应用,自从1999 年和2000 年科学杂志连续两年
14、将干细胞的研究评为年度世界十大科学成就以来,关于干细胞及其在临床上的应用等研究就蓬勃发展起来。,干细胞的定义,干细胞是一类具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞群体，即这些细胞可以通过细胞分裂维持自身细胞群的大小，同时又可以进一步分化成为各种不同的组织细胞，从而构成机体各种复杂的组织器官。,干细胞分类,干细胞可分为胚胎干细胞和成体干细胞。 胚胎干细胞(embryonic stem cells ,ESC) 是来源于人或动物胚胎内细胞团或原始生殖嵴的一种多能细胞系。胚胎干细胞几乎可以向所有的成年组织分化。 成体干细胞(adult stem cells , ASC) 存在于胎儿和成人各种组织及器
15、官中,来源广泛, 是一类具有多向分化潜能的细胞群体,有横向分化(trans-differentiation) 能力。,胚胎干细胞和成体干细胞的特点,胚胎干细胞更具有全能性,但涉及伦理问题，存在免疫排斥问 题；胚胎干细胞可能分化为肿瘤样的组织；在临床应用中受到取材困难等因素的限制。 成体干细胞不涉及伦理问题；组织不会生成肿瘤样组织；不存在免疫排斥的问题。成体干细胞在临床应用方面可能有更广阔的前景。,干细胞的多向分化潜能,通常情况下，干细胞具有确定的分化方向及途径（纵向分化）。 如今发现，在特定条件下，干细胞根据其特异的微环境的不同而发育成与其自身组织来源不同的组织细胞，称之为干细胞的转分化/横向
16、分化。,已被实验证实的多向分化潜能,骨髓细胞骨骼肌细胞、心肌细胞、肝细胞、内皮细胞、神经细胞； 肌肉细胞血液细胞； 神经干细胞血液细胞、骨骼肌细胞； 造血干细胞骨骼肌细胞、心肌细胞、肝实质细胞、胆管和多种上皮以及内皮细胞； 肝卵圆细胞胰腺内分泌激素形成细胞。,干细胞分化为肝系细胞,骨髓细胞是较早被认识的成体干细胞之一,人们早就利用骨髓移植来根治造血系统恶性疾病。 目前骨髓是肝系细胞主要的肝外来源的说法已经较为肯定。有研究表明，骨髓干细胞在诱导因子的作用下能分化为肝系细胞。,干细胞在肝脏疾病领域的应用,我国是病毒性肝炎、原发性肝癌的高发区, 目前尚缺乏广泛可行的有效治疗手段, 尽管肝移植可作为治疗肝衰竭的有效手段, 但手术复杂、排斥反应、生存率不高等缺点, 尤其是供体肝缺乏, 使得这一治疗措施难以广泛推广。,干细胞在肝脏疾病领域的应用,
