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1、分子生物学常用技术及其应用,第一节 基因工程,一基因工程的基本概念 DNA重组不同来源的DNA分子通过末端共价连接而形成重新组合的DNA分子的过程。 基因工程采用人工方法将不同来源的DNA进行重组，并将重组后的DNA引入宿主细胞中进行增殖或表达的过程。 生物技术包括基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程。 克隆通过无性繁殖所产生的与亲代完全相同的子代群体。,二、工具酶 限制性核酸内切酶：能从中间有选择性地切割DNA分子特异序列。 DNA连接酶 DNA聚合酶 逆转录酶多核苷酸激酶 碱性磷酸酶 末端脱氧核苷酸转移酶,三、载体 载体必须符合以下几点要求： （1）能在宿主细胞内复制并具有较高的拷贝数
2、（2）容易进入宿主细胞 （3）具有多个限制性核酸内切酶单一的酶切位点 （4）容易从宿主细胞中分离纯化 （5）有容易被识别筛选的标志 常用的载体包括：质粒、噬菌体、粘粒、病毒,由质粒与噬菌体构成,四、重组DNA技术的基本原理制备DNA片段，并通过载体将其导入受体细胞，在受体细胞中复制、扩增，以获得单一DNA分子的大量拷贝。,五、重组DNA技术的基本过程 （一）制备目的基因和载体； （二）DNA的重组； （三）重组DNA导入宿主细胞 （四）DNA重组体的筛选和鉴定 （五）DNA重组体的 扩增和表达,（一）目的基因的 制备：目的基因的筛选和分离可采用以下方法进行： 1直接从染色体DNA中分离： 仅适
3、用于原核生物基因的分离，较少采用。,2人工合成：根据已知多肽链的氨基酸顺序，利用遗传密码表推定其核苷酸顺序再进行人工合成。适应于编码小分子多肽的基因。,3从mRNA合成cDNA： 采用一定的方法钓取特定基因的mRNA，再通过逆转录酶催化合成其互补DNA（cDNA），除去RNA链后，再用DNA聚合酶合成其互补DNA链，从而得到双链DNA。这一方法通常可得到可表达的完整基因。,4从基因文库中筛选：将某一种基因DNA用适当的限制酶切断后，与载体DNA重组，再全部转化宿主细胞，得到含全部基因组DNA的种群，称为G文库(genomic DNA library)。 将某种细胞的全部mRNA通过逆转合成cD
4、NA，然后转化宿主细胞，得到含全部表达基因的种群，称为C-文库(cDNA library)。C-文库具有组织细胞特异性。,5利用PCR合成： (聚合酶链反应） 如已知目的基因两端的序列，则可采用聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术，在体外合成目的基因。,（二）目的基因与载体连接(DNA的重组）,主要通过DNA连接酶和双链DNA粘性末端序列互补结合。 1、粘性末端连接利用同种限制性内切酶切开载体和DNA分子，能产生相同的粘性末端，在T4连接酶作用下遍可互补。2、同聚物加尾连接在酶的催化下人为在DNA链3末端添加多聚脱氧单核苷酸，制造粘性末端。 3、平末端
5、连接在 T4 DNA连接酶的作用下，直接连接DNA平端末端，效率较低。 4、人工接头连接 在平端DNA末尾加上人工合成的具有限制性DNA内切酶的DNA片段，再用内切酶作用产生粘性末端。,（三）将外源性DNA导入宿主细胞 常用的方法两种： 1、转化转化指将质粒或其他外源性DNA导入处于感受态的宿主细胞，并使其获得新的表型的过程。 包括CaCl2制备感受态宿主细胞、法电穿孔法、显微注射法、基因枪法等 2、感染感染以噬菌体进入宿主细胞或病毒进入宿主细胞中繁殖的过程。 用灭活的噬菌体或病毒的蛋白质外壳包裹重组的DNA分子，使其进如宿主细胞。,（四）目的基因的筛选和鉴定 常用的方法包括：遗传学方法、免疫
6、学方法、核酸杂交法、PCR、核苷酸序列测定、DNA限制内切酶图谱分析法等。 遗传学法：载体经常带有抗药基因，利用含有该药物的培养基直接分离。 分子杂交法：利用32P标记的探针与被检对象进行杂交鉴定。 免疫学法：利用特异性抗体与基因表达产物结合的方法。,（五）克隆基因的表达不同的目的基因在真核和原核表达体系中表达结果不同。 真核细胞可用于表达原核基因 原核细胞表达的真核基因产物还需要进一步加工处理，如甲基化、糖基化、折叠,六、基因工程在医学中的应用 应用于医学基础研究 疾病的诊断和基因治疗 生产基因工程药物：既可改造传统制药工业，提高产量，也可用于新蛋白类药物的生产。 制造转基因动物：可用于药物
7、蛋白生产、器官移植 人类基因工程组计划 蛋白质工程：通过基因工程改变蛋白质,第二节 核酸的分子杂交,核酸分子杂交依据两条单核苷酸链之间的碱基互补、变性和复性的原理，用已知碱基序列的单链核苷酸片段作为探针，检测待测样品中是否存在与其互补的同源核苷酸序列的方法。,一、核酸分子杂交的基本原理 探针核酸分子与变性的被检核酸分子复性，通过碱基互补的原则，形成杂交分子。 探针必须带有标记，可用于定性和定量分析,（二）核酸分子杂交的基本方法 Southern印迹杂交待测核酸是DNA片段，是DNA与DNA杂交，指将酶切并经电泳分离的DNA片段固定在载体上，与探针进行杂交。 Northern印迹杂交待测核酸是R
8、NA片段，指将待测RNA经分离后固定在载体上，与探针进行杂交。 斑点及狭缝印迹杂交直接将变性核酸固定在载体上，用探针进行杂交。优点是一张膜同时可用多种不同探针检测 原位杂交直接用探针和细胞内的核酸进行杂交,三、探针的特征 （一）探针的特征 1、要带有标记物 2、应是单链 3、具有高度的特异性 4、探针长段不一，短探针杂交速率快且特异性强 5、标记的探针应具有高度的灵敏性、稳定、标记方法简便、安全,（二）探针的种类与制备 1、基因组DNA探针直接从基因组分离 2、cDNA探针通过逆转录生成 3、寡核苷酸探针人工聚合成 4、RNA探针转录生成,（三）探针的标记物 放射性标记物：32P、35S、3H
9、、125I、131I 非放射性标记物：生物素、地高辛、荧光素、酶 （四）标记方法 体内标记法：将标记物掺入培养基 体外标记法：化学法或酶法,第三节 聚合酶链反应 polymerase chain reaction,聚合酶链反应（PCR）体外高效、快速、特异地扩增目的基因或DNA片段的技术。,一、PCR 的基本原理,其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供一种合适条件模板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲液系统和DNA变性、复性及延伸的温度与时间等，使目的DNA得以迅速扩增,DNA的体内复制：,原料：模板DNA（基因组DNA）， 随机小分子RNA引物，dNTP
10、s酶：DNA聚合酶，解旋酶，引发酶反应条件：胞液环境，37 反应过程：模板DNA解旋、引发体的形成、延长（三阶段）产物：模板DNA （基因组DNA）拷贝数增加一倍,原料：模板DNA（基因组DNA ，cDNA） 一对特异性寡核苷酸引物，dNTPs酶：Taq DNA聚合酶反应条件：合适的缓冲液，三种变化的温度（94，50-70，72 ），一定的循环数（25-35）反应过程：DNA模板变性（解链）、 模板与引物退火 、引物延伸 （三阶段，多循环）产物：目的DNA（特异性）拷贝数增加2n倍.,PCR,二、过程（经典操作过程） 1、高温变性（DNA模板变性）,与体内DNA解链过程不同，PCR中作为模板的
11、双链DNA是通过95左右的高温使其发生变性，形成单链DNA,2、低温退火（模板与引物退火）,PCR通常需要两条寡核苷酸链作为DNA合成时的引物（primer）,这两个引物分别与待扩增模板DNA的目标片段两端的序列互补。在降低温度的过程中（一般为70-75 ，通过控制退火条件，引物就能准确地与扩增区域的两端配对。,引物短，不易缠绕；设计的引物是与模板DNA两端序列互补；引物的量远大于模板分子的量，引物与模板DNA形成双链的几率远远高于DNA分子自身的复性。,3、适温延伸（72 ）,在PCR反应体系中的DNA聚合酶，能够催化反应体系中游离的单核苷酸（dNTPs）由引物53方向，按碱基配对的原则延伸
12、，形成两条与模板DNA互补的复制链。,新合成的链又可作为下轮循环反应的模板。,热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环 每一循环后的模板均比前一循环增加1倍。理论上讲，扩增DNA产量是呈指数上升的，即n个循环后，产量为2n拷贝。而实际上，PCR的扩增倍数为（1+X）n，X为扩增效率，平均为75%,百万倍扩增,尽管PCR扩增DNA非常有效，但目的DNA序列的指数扩增并不是一个无限制的过程。在正常的反应条件下，经30次循环之后，酶的催化反应趋于饱和，就会出现平台效应 (Plateau) ，产物的量不再增加。“平台效应”出现的迟早还取决于酶的性能、模板DNA的拷贝数、dNTP浓度等多种因素。,RT
13、PCR 以mRNA为原始模板的PCR，亦称逆转录PCR。 逆转录反应在42 进行，随后将反应混合物加热至95 5min，灭活逆转录酶，取2ul反应产物，按DNA为模板的PCR反应步骤，进行扩增反应。,三、PCR在医学中的应用,对人类遗传信息的认识和研究基因工程药物与疫苗生产转基因动物和植物制造基因诊断与基因治疗,镰刀型红细胞贫血,Chehab等设计一对引物把含有突变的DNA片段（共294bp）扩增，扩增产物用限制性内切酶 OxaN I消化，琼脂糖凝胶电泳后染色观察：正常人有2个片段，191 和 103bp，镰刀状红细胞贫血的纯合子，仅有一个片段294bp 杂合子有191、103和294bp 3
14、个片段,综合了分子生物学、微电子学、微加工和计算机等学科知识 本质：在固定的玻片等载体上的微型生物化学分析系统，芯片上每平方厘米可排列成千上万生物分子，能快速准确地检测核酸，并获取样品中的有关信息。,第四节 DNA芯片技术,一、DNA芯片技术的概念和主要类型DNA芯片技术指将大量已知寡核苷酸或DNA探针（不标记）按特定的排列方式固化在固相支持物（多用计算机硅芯片）表面，按碱基互补配对的原则，与标记的特异的单链DNA或RNA（待测样品）分子杂交形成双链，通过对杂交信号的检测分析，得出样品分子的数量和序列信息。,DNA芯片主要类型 原位合成芯片才用光介导和压电打印等技术在芯片的特定部位原位合成寡核
15、苷酸而制成的芯片 DNA微集阵列将预先制备的DNA片段以显微打印的方式有序地固化于支持物表面而制成的芯片,二、DNA芯片技术的基本原理与方法 DNA芯片技术工作流程主要包括： 芯片制备关键 样品的准备与标记 杂交 信号检测和数据分析处理,（一）、芯片的制备 1、支持物的预处理 支持物包括实性材料和膜性材料 实性材料包括硅芯片、玻片和瓷片等实性材料需要进行预处理，使其表面衍生出羟基、氨基等活性基团，并在表面用光敏材料保护。 膜性材料包括聚丙烯膜、尼龙膜、硝酸纤维素膜等膜性材料则要包被氨基硅烷或多聚赖氨酸。,2、原位合成芯片的制备 两种方法：光介导原位合成法、压电打印合成法 利用排列组合的原理，在
16、一块载体的不同位置合成不同的寡核苷酸片段,3、DNA微集阵列的制备 包括制备探针、打印、探针固化三个步骤,（二）样品的准备 包括分离纯化、扩增和标记 （三）分子杂交 一般30分钟内完成 （四）检测分析 根据产生的荧光强度分析样品含量及样品结合的探针类型，最后分析样品核苷酸序列。,三、DNA芯片技术的应用（自学） DNA序列测定 突变及多态性分析 基因表达分析 基因组研究 基因诊断 药物研究与开发,基因诊断以DAN或RNA为诊断材料，DNA反映基因的存在状态、RNA反映基因的表达状态，通过检查基因的存在、缺陷或表达异常。 常用的方法：包括核酸分子杂交、PCR、单链构象多态性检测、限制性内切酶酶谱分析、DNA序列测定、DNA芯片技术,第五节 基因诊断和基因治疗,基因治疗指以正常基因矫正、替代缺陷基因，或从基因水平调控细胞中缺陷基因的表达的一种治疗疾病的方法。 基本过程： 1、选择制备目的基因 2、选择基因转运载体 3、选择靶细胞 4、转移基因 5、外源基因表达的筛选 6、回输细胞到体内,
