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1、第三章 血细胞分析仪检验,简介,手工计数法的局限性 仪器优势：精度高、速度快、易操作、功能强 血液分析仪发展 血液分析仪功能：细胞计数、白细胞分类、扩展功能,20世纪50年代，美国库尔特（W.H.Coulter）发明电子血细胞计数仪并申请专利。,血液分析仪优势 检测项目多 速度快 精度高 易操作,第一节 检测原理,1.电学2.光学,电阻法,射频电导法,激光散射法：染色和非染色,分光光度法-检测血红蛋白,一. 血细胞计数原理,电阻抗法,经典的库尔特原理,测量细胞数量和体积 三分群血液分析仪主要原理,电阻抗法,血小板与红细胞同一检测通道 特殊装置辅助:扫流技术、鞘流技术、浮动界标。,射频电导法,电
2、磁波通过细胞发生衰减，与细胞内部化学成分、核质比、颗粒等有关。 特别有助于鉴别体积相同，内部结构不同的细胞。,激光散射法,在不同角度测定散射光强度，与细胞表面结构和内部颗粒、细胞核有关。比电阻抗法分群准确，是五分类仪器主要检测原理。,光源：气体激光、固体激光、钨光源 鞘流：流体动力聚焦 细胞悬液 光检测器,1,4,3,激光散射法示意图,1样本流 2鞘流液 3激光源 4透镜 5低角度散射光 6高角度散射光,6,5,2,激光散射法,低角度散射光（前向散射光），反映细胞大小和数量。 高角度散射光（侧向散射光），反映细胞内部颗粒、细胞核等。 流式细胞术光散射：荧光染色，得到荧光强度信号，与细胞所含核酸
3、有关。优于阻抗法，是五分类仪器的主要原理之一。,12,半导体激光,染色后的白细胞,FCM原理,激光散射法运用,白细胞计数 红细胞计数：低角度(23)：测量红细胞体积。高角度(515)：测定血红蛋白浓度。 血小板计数：低角度(23)：测量细胞大小。高角度(515)：测量细胞密度。可与小RBC、RBC碎片区分。加入荧光染色，成熟RBC无DNA/RNA，不被染色。未成熟血小板染色较成熟血小板强。,网织红细胞检测原理,对网织红细胞内RNA成分染色。 染色剂有：非荧光染料（新亚甲蓝）和荧光染料 (噁嗪、聚次甲基）非荧光染料染色法：VCS技术RNA越多光散射越强，可检测网织红细胞成熟度得到参数：Ret%、
4、 Ret#、IRFHLRMCVrRDWr,网织红细胞参数检测原理,荧光染料染色法聚次甲基染RNA、噁嗪染DNA,RBC,LFR,PLT,MFR,HFR,得到参数： Ret%、 Ret# HFRMFRLFR IRF Ret-He,荧光强度,前向散射光,有核红细胞参数检测原理,VCS法非白细胞区域：有核红、血小板聚集、 大血小板、疟原虫等。 流式细胞激光散射法聚次甲基荧光染色：NRBC裸核化， 荧光强度比白细胞低。,前向散射光,侧向荧光,二. 白细胞分类原理,白细胞三分群原理,白细胞直方图 仪器将体积为35450fL的血细胞，分为256个通道 （channel）。每个通道：1.64fl。根据细胞大
5、小，分别置 于不同的通道中，显示血细胞体积分布直方图(Histogram)。,白细胞直方图,1.35-90fl小细胞群：淋巴 2.90-160fl中间细胞群： 单核、嗜酸、嗜碱、幼稚 3.160-450fl大细胞群： 中性粒细胞,直方图出现异常，不同部位有不同含义,体积 电导 光散射,白细胞五分类检测原理,VCS原理,VCS,旋转光散射,体积,激光散射法（钨光源）、过氧化物酶染色,过氧化物酶活性强度：嗜酸中性粒细胞单核。 淋巴和嗜碱细胞无过氧化酶活性,流式细胞光散射、电阻抗、射频、特殊细胞染色,1.4DIFF通道阻抗+射频：分粒细胞、淋巴、单核三群流式光散射：溶解红细胞、血小板，白细胞荧光染色
6、，荧光强度与细胞所含核酸有关。先分四群：中性粒细胞和嗜碱细胞，淋巴，单核，嗜酸和未成熟粒细胞。 2.嗜酸细胞通道 3.WBC/BASO通道碱性溶血剂破坏其他白细胞。 4.IMI通道加入硫化氨基酸，与幼稚细胞结合，且不被溶血剂溶解。,WBC/BASO通道,完成五分类,多角度偏振光散射法（MAPSS),红细胞内血红蛋白逸出，鞘液进入，折光系数与 鞘流相当，不干扰白细胞检测。 4个角度： 0前向散射光：细胞大小、数量 10侧向散射光：细胞内部结构和核染色质的复杂性。 90偏振光：细胞内颗粒及核分叶情况 90D垂直角度去偏振散射光：鉴别嗜酸细胞,MAPSS,双流体（双鞘流）动力连续系统,双鞘流：有2个
7、鞘流装置，经第一束鞘流后用阻抗法测细胞体积，经第二束鞘流后测定光吸收测细胞内部结构。 1.白细胞计数通道：电阻抗 2.白细胞分类通道：双鞘流+细胞化学染色染液中含溶血素及氯唑黑E，对单核细胞初级颗粒、嗜 酸颗粒、中性颗粒及细胞膜（细胞膜、核膜、颗粒膜）染 色。 3.嗜碱性粒细胞通道,分光光度法,测定血红蛋白: 溶血剂使红细胞溶血，释放出血红蛋白，血红蛋白与溶血剂中某些成 分结合，形成稳定化合物，在特定的光波（530-550nm）下比色， 吸光度变化与血红蛋白浓度成正比(Lambert-Beer比色定律)。 溶血剂1.含氰化物：形成氰化血红蛋白，540nm(改良HiCN 法）。氰化 物有毒。2.
8、不含氰化物:如SLS（月桂酰硫酸钠）法，需用HiCN校准。,方法学评价,三分类已较少用五分类，准确度及精密度更高。仍无法取代人工镜检。,第二节 临床应用,红细胞参数,红细胞体积分布宽度（RDW） 反映红细胞大小不一致的程度，与MCV结合，用于贫血的 分类。RDW-SD和RDW-CV。 1.鉴别均为小细胞低色素的贫血 2.早期诊断缺铁性贫血 2.MCV和RDW均增高：巨幼细胞性贫血 3. MCV和RDW均正常：再障、慢性失血性贫血,红细胞参数,血红蛋白分布宽度（HDW） 反映红细胞内HB含量异质性。 HDW和RDW明显增高，见于遗传性球形红细 胞增多症（小细胞不均一性高色素）。 HDW增高，RDW正常见于轻型-珠蛋白生成 障碍性贫血。 球形细胞平均体积（MSCV) 遗传性球形红细胞增多症MSCV2+ 血小板聚集;血小板形态异常2+ Dohle小体的粒细胞2+，中毒颗粒中性粒细胞2+，空泡变性粒细胞2+ 原始和幼稚细胞1个，早幼粒细胞和中幼粒细胞1个 ，晚幼粒细胞2个 非典型淋巴细胞5个 浆细胞1个 3. 统计 要求假阴性率5%（具有诊断意义的重要参数，不能出现假阴性）、假阳性率 20%、总镜检率30%，则该仪器镜检规则验证通过。,
