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1、实验八考马斯亮蓝 G-250 法测定蛋白质含量一 实验目的学会用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量二 实验原理考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水微区结合，这种结合具有高度的敏感性。 考马斯亮蓝G-250的磷酸溶液呈棕红色， 最大吸收峰在 465nm当它与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色其最大吸收峰改为595nm ， 考马斯亮蓝 G-250-复合物的高消光效应导致了蛋白质定量测定的高敏感度。在一定范围内，考马斯亮蓝G-250-复合物呈色后，在595nm下吸光度与蛋白质含量呈线性关系，故可以用于蛋白质浓度的测定。三 实验器材（1）旋涡混合器。（2）试管 1.5cm15cm （8）（3）吸管 0.10ml （
2、1） ，0.50ml（2） ，1.0ml（2） ，2.0ml （1） ，2.0ml （1） 。（4）722型（或 7220型）分光光度计。（5）容量瓶 1000ml（1） 。（6）量筒 100ml（1） 。（7）电子分析天平。四 实验试剂1、9NaCL溶液。2、标准蛋白液； 牛血清白蛋白 （0.1mg/ml） ，准备称取牛血清白蛋白0.2g ，用 0.9%NaCl溶液溶解并稀释至2000ml。3、染液：考马斯亮蓝G250(0.01%), 称取 0.1g 考马斯亮蓝 G250溶于 50ml95% 乙醇中，再加入 100ml 浓磷酸，后加蒸馏水定容到1000ml。4、样品液：取牛血清白蛋白（0.1
3、mg/ml）溶液，用 0.9%NaCl稀释至一定浓度。五 实验方法（一）标准曲线的制备1、取 7 支干净试管，按表15 进行编号并加入试剂。2、混匀，室温静置 3min，以第 1 管为空白，于波长 595nm处比色，读取吸光度，以吸光度为纵坐标，名标准液浓度（ug/ml ）作为横坐标作图得标准曲线。表 15 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度标准曲线的制备试剂管号1（空白）2 3 4 5 6 7 标准蛋白液 /ml 0.9%NaCl/ml 考马斯亮蓝染液/ml 蛋白质浓度（g/ml）A595nm1.0 4.0 0 0.1 0.9 4.0 10 0.2 0.8 4.0 20 0.3 0.7 4.0 30
4、 0.4 0.6 4.0 40 0.6 0.4 4.0 60 0.8 0.2 4.0 80 （二）样品的测定另取一支干净试管，加入样品液1.0ml 及考马斯亮蓝染液4.0ml ，混匀，室温静置3min， 于波长 595nm处比色，读取吸光度，由样品液的吸光度查标准曲线即可求出含量。注意样品蛋白质含量应在10-100ug 为宜。一些阳离子如K+ 、Na+、Mg+、乙醇等物质对测定无影响，而大量的去污剂如SDS等会严重干扰测定。六 注意事项1研究表明， NaCl、KCl、MgCl2、(NH4)SO4、乙醇等物质对测定无影响，而大量的去污剂如 TritonX-100 、SDS等严重干扰测定，少量的去
5、污剂及Tris 、乙酸、 2- 巯基乙醇、蔗糖、甘油、 EDTA 有少量干扰，可很容易地通过用适当的溶液对照而消除。同时注意，比色应在显色2min-1h 内完成；如果测定很严格，可以在试剂加入后的5-20min 内测定吸光度，因为在这段时间内颜色最稳定。2测定那些与标准蛋白氨基酸组成有较大差异的蛋白质，有一定误差，因为不同的蛋白质与染料结合量是不同的，故该法适合测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。3待测溶液中蛋白质浓度不可过高或过低，应控制在100-800ug/ml 为宜。七 思考题1Bradford 法测定蛋白质含量的原理是什么？应如何克服不利因素对测定的影响？2为什么标准蛋白必须用凯氏定氮法测定纯度？
