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1、主要试剂p8V5 噬菌粒载体 (AHymaxlnc) LB氨苄青霉素培养基(1蛋白胨， 0，5酵母提取物，0.5 NaCl，100ug/m1 氨苄青霉素 ) Bst限制性内切酶(New England biolabs) 10 NEBuer 3 缓冲液(0.5m01/L Tris-HCl， 25时调节其pH 为 7.9， 1mol/L NaCl，100mm01/L MgCl2 ，10mmol/L 二硫苏糖醇 ) 酚：氯仿 (1：1) TE缓冲液 (10mmol/LTris-HCl，1mmol/LEDTA， pH 8.0) 乙酸钾溶液 (分别按 10、 15、20、 25质量体积比溶于2mmol/
2、L EDTA 溶液中，加溴化乙锭至终浓度为1ug/m1) Qiagen P1asmid Maxi Kit(Qiagen) 3mol/L 乙酸钠溶液， 25时调节其pH 为 5.4 TBE缓冲液(0.089mol/L Tris-HCl， 0.089mol/L 硼酸，2mmol/L EDTA， pH 8.3) 8聚丙烯酰胺 /7mol/L 尿素 /TBE 凝胶2Prep TBE-urea上样缓冲液(Invitrogen) Bst、 BsiHKAI限制性生内切酶(New England biOlabs) 5 X DNA聚合酶缓冲液 (200mmol/l Tris-HCl ，pH 7.5，100mmo
3、l/LMgCl2 ， 250mmol/LNaCl) DNA 聚合酶 2.0(sequenase) (Amet-Sham BiOSCiences) 脱氧核糖核苷酸三磷酸混合液(dNTP) (dNTP各为 25mm01/L) Microspin S-200 HR 柱(Amersham BiOSCience8) 10 X 连接缓冲液 (500mm01/L Tris-HCl，pH 7.8， 100mmol/L MgCl2 ， 100mm01/L 二硫苏糖醇，1mmol/L 三磷酸腺苷，500/(g/m1BSA) T4DNA连接酶 (NewEnglandBl01abs) E.coli MCl061 F菌
4、株 (Aflyrllaxlnc) superbroth 培养基 (3.5蛋白胨， 2酵母提取物，0.5NaCl，通过 NaOH 调节 pH 至 7.5) SOC培养基 (2蛋白胨，0.5酵母提取物， 10mmol/LNaCl， 2.5mmol/L KCl， 10mm01/L MgCl2 ，10mm01/L MgSO4 ，20mm01/L 葡萄糖 ) LB氨苄青霉素培养基3mol/L 乙酸钠SOPamp/glu培养基 2蛋白胨，1酵母提取物， 100mmol/LNaCl ， 15mmol/L K2HPO4， 5mmol/L MgCl2， pH7.2，100ug/m1 氨苄青霉素， 0.2 (w/
5、v) 葡萄糖 LB培养基 /15 甘油 (体积分数 ) VSC-M13辅助噬菌体 (Stratagene) 20(w/v) 阿拉伯糖20mg/m1 卡那霉素 (Kan) PEG/NaCl(20聚乙二醇， PEG平均分子量8000，2.5mmol/LNaCl) 磷酸盐缓冲液 (PBS) (0.137mmol/L NaCl， 3mmol/LNa2HPO4 ， L4mm01/L KH2PO4， 27mmol/LKCl，25调节 pH 为 7.4) SOP amp/glu 培养基主要设备荧光氧化铝薄层层析板(J.T.Baker) Microspin Sephadex G-25 柱 (Aruer-Sha
6、m BiOSCiences) 电转化仪 (E.coli pulser，BiORad) 13 ml 离心管 (Sarstedt) 实验步骤1. 载体的准备1) p8V5 噬菌粒载体DNA 提取及用Bst限制性内切酶消化a. 挑取单克隆MCl061p8V5 菌株到 5ml LB 氨苄培养基中，于37振摇培养6 8 小时，将培养物加入到含有1L LB氨苄培养基的2.8LFernbach 大型锥形瓶中，37振摇培养过夜。b. 依照产品说明， 用 QiagenPlasmid Maxi 柱提取双链噬菌粒质粒DNA， 可得到约1mg双链噬菌粒载体DNA。c. 将 200ug p8V5DNA，40ul 10N
7、EBuffer 3 缓冲液和 20ul Bst限制性内切酶(200 单位)混合，调整终体积为400ul，于 55酶切过夜。d. 上述反应物用等体积的酚；氯仿抽提两次，再用氯仿抽提一次。e. 抽提物中加入40ul 3mol/L 乙酸钠溶液和880ul 乙醇，以沉降DNA。于室温离心10 分钟后，小心去除上清，DNA 沉淀用 40ul TE 缓冲液重悬。2) 乙酸钾梯度离心a. 缓慢地按浓度递减逐层加入上述乙酸钾溶液各1ml 于 13mm 55mm 异质同晶聚合物 (polyallomer) 超高速离心管中。小心在上层加入200ul 消化过的p8V5，使用 SW50.1 转子于 2028000g(
8、48000r/min) 离心 3 小时。b. 在手提紫外灯下观察离心管中线性化DNA 条带的位置。用注射器逐层吸出条带，用水饱和的丁醇抽提数次以除去溴化乙锭。c. 将上述抽提物的水相与0.1 倍体积的3mol/L 乙酸钠溶液以及2 倍体积的乙醇混合，室温离心10 分钟以沉降DNA。小心除去上清后，沉淀用70乙醇洗涤后重悬于TE缓冲液中。于 260nm 测定 DNA 溶液的吸光度值以确定DNA 溶液的浓度。2. 插入片段的准备3. 连接插入片段与Bst消化的p8V5 载体1) 连接反应a. 在 13m1 离心管中混合下列物质：20ug p8V5 载体 (经 Bst酶切和纯化) 1.25ug 插入
9、 DNA 片段 (经 Bst、 Bsi HKAI酶切和纯化 ) 200ul 10连接缓冲液4ul T4 DNA 连接酶加水至反应总体积为2m1 b. 于 14孵育过夜。加入1/10 体积的 3mol/L 乙酸钠溶液和2 倍体积的乙醇。于10000r/min 转速 (JA.20 转子 )下离心 15 分钟。除去上清，用400ul TE缓冲液将沉淀重悬。再加入 1/10 体积的 3mol/L 乙酸钠溶液和2 倍体积的乙醇， 离心后将沉淀用70乙醇洗涤并干燥，再加入20ul TE 缓冲液将连接后的DNA 重悬。2) 准备电感受态细胞a. 培养 E.coli MCl061 F菌株于 1L superb
10、roth 培养基直至对数生长期中期(OD6000.5)。b. 在冰上冷却培养物30 分钟。 于 4、5000 r/min 转速 (JA.20转子 )下离心细菌悬液15 分钟。c. 用 1L 冷水将细菌沉淀重悬。重复上面离心步骤，用0.5L冷水将细菌沉淀重悬。d. 重复上面离心步骤，用10ml 10甘油将细菌沉淀重悬。于46000r/min 转速下离心细菌悬液15 分钟。e. 用 10甘油重悬细菌沉淀，至终体积为2m1。按每管200/ul 分装后先于干冰转移到 -70冷冻保存。3) 电转化a. 准备 4 个转化反应，其中每个电转化杯中含有200ul 细菌和 5ul 连接后的 DNA，于 2.5k
11、V 电压下电转化。 转化后， 立即将细菌转移到2m1 SOC培养基中， 在无选择压的条件下于 37培养 1 小时。b. 将 4 个转化反应产物混合， 并将取出少量产物以10 倍递减稀释。 将 100ul 10-4-10-5，稀释液涂布于LB氨苄青霉素琼脂培养基平板上，根据菌落生长数计算转化的效率。剩余的转化反应产物加入到500m1 SOPamp/glu培养基中，于 37振摇培养直至OD600值达到 0.8。c. 取 100m1 上述培养物， 从库中生成噬菌体。剩余的细胞悬液于6000r/min 转速下离心 10 分钟。d. 用 10m1LB培养基 /15 甘油重悬细菌沉淀， 将其转移到 Nun
12、c冻存管中，每管 1m1，并将其于 -70冷冻保存，以备将来扩增库之用。4. 扩增与储存1) 辅助噬菌体感染和p诱导产生a. 按 10:1 感染重数加入VSC-M13辅助噬菌体 （约 1012空斑形成单位(pfu)）到 100ml 已转化的细菌中。于37静置孵育30 分钟。b. 将上述培养物加入到一个含有500ml SOPamp/glu 培养基的三角瓶中。 加入 0.6 m1卡那霉素溶液和6ml 20阿拉伯糖溶液。于37振摇培养过夜。2) 收集扩增后的噬菌粒库a. 于 4 12000g 转速（对于JA-10转子为 8000r/min ）将上述过夜培养物离心。将上清转移到一个新的离心管中，并再次离心。b. 将上清转移到另一个新的离心管中，加入0.2 倍体积的PEG/NaCl以沉降噬菌体。充分混合后冰上静置1 小时。c. 于 8000r/min 离心 15 分钟将噬菌体沉降。小心将上清除去，用10ml PBS将噬菌体沉淀重悬。滴定噬菌体储液；滴定结果出来前，噬菌体悬液可在4短期保存24 小时。若需要长期保存，可将噬菌体悬液以1000 倍库当量，于 -20分批冻存。
