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1、DNA重组技术的基本工具,抗虫害的玉米,转基因 鲑鱼,基因工程产品,转黄瓜抗青枯病基因的甜椒,乳汁中含有人生长激素的转基因牛(阿根廷),基因工程的概念,基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。,想一想:获得转基因抗虫棉需要做哪些工作呢?,基因工程培育抗虫棉的简要过程：,普通棉花(无抗虫基因),苏云金芽孢杆菌,提取,抗虫基因,与运载体DNA拼接 导入,棉花细胞(含抗虫基因),转基因棉花植株,1）提取目的基因 2）目的基因与载体结合 3）将目的基因导入受体细胞 4）目的基因的检测和表达,基因
2、工程操作的四个基本步骤,上述培育抗虫棉的关键步骤是什么？,关键步骤,实现这一精确的操作过程的工具是什么呢?,操作工具,限制性核酸内切酶,DNA连接酶,载体,“分子手术刀”,“分子缝合针”,“分子运输车,分子手术刀-限制性核酸内切酶(限制酶),A.来源:,主要从原核生物中分离纯化,想一想: 这类酶在原核生物中起什么作用?,原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是，生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。,限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效
3、，从而达到保护自身的目的,限制酶是一类酶，不是一种酶,B.作用:,识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列,并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开.,迄今为止，基因工程中使用的限制酶绝大部分都是从细菌或霉菌中提取出来的，它们各自可以识别和切断DNA上特定的碱基序列。 细菌中限制酶之所以不切断自身DNA，是因为微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，对于外源入侵的DNA可以降解掉。生物在长期演化过程中，含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制
4、酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。,2.为什么细菌中限制酶不剪切细菌本身的DNA？,迄今为止已经从近300中微生物中分离出约4000种限制酶,限制酶所识别的序列，无论是6个碱基还是4、5、8个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。,C.识别序列的组成:大多数由六个核苷酸组成,D.切割后产生的DNA片段末端的形式,黏性末端,平末端,黏性末端：被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的 核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。,什么叫平末端？,平末端是如何形成的？,当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的
5、DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。,当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，产生的是平末端。,当限制酶从识别序列的中心轴线两侧切开时，产生的是黏性末端。,DNA连接酶-“分子缝合针”,切断的DNA片段要与受体细胞的DNA连接，你觉得可以用什么酶？,1、种类：,两类,DNA连接酶“分子缝合针”,这两种连接酶催化反应基本相同，都是连接双链DNA的缺口，而不能连接单链DNA。 Ecoli连接酶只能连接黏性末端； T4连接酶既可“缝合”黏性末端，又可“缝合”平末端，但连接平末端之间的效率比较低.,DNA连接酶“分子缝合针”,DNA连接酶与DNA聚合酶一样吗？为什么？,DNA连接酶连接黏
6、性末端之间的磷酸二酯键，形成重组的DNA分子。,作用部位：,磷酸二酯键,不是一回事。DNA连接酶和DNA聚合酶都是形成磷酸二酯键（在相邻核苷酸的3位碳原子上的羟基与5位碳原子上所连磷酸基团的羟基之间形成），那么，二者的差别主要表现在什么地方呢？ （1）DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的3末端的羟基上，形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是在单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键。 （2）DNA聚合酶是以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNA链；而DNA连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来。因此DNA连
7、接酶不需要模板。 此外，二者虽然都是由蛋白质构成的酶，但组成和性质各不相同。,DNA聚合酶和DNA连接酶有何相同点和不同点？,基因的载体“分子运输车”,载体必须具备的条件：1、能够在宿主细胞中复制并稳定地保存；2、具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接；3、具有某些标记基因，便于进行筛选。（如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等 ）4、对受体细胞无害,载体的作用：1、将外源基因转移到受体细胞中去。2、利用运载体在受体细胞内，对外源基因进行大量复制。,常用的载体有：质粒，噬菌体的衍生物，动植物病毒等,质粒,质粒是基因工程最常用的运载体，它广泛地存在于细菌中，是细菌染色体外能够自主复制的很小
8、的环状DNA分子，大小只有普通细菌拟核DNA的百分之一。,要对天然质粒进行人工改造,想一想:天然的DNA分子可以直接用作基因工程载体吗?,DNA重组技术的基本工具,1.手术刀(基因的剪刀)-准确切割DNA,2.缝合针(基因的针线)-将DNA片段再连接起来,3.运输工具(基因的运载体)-将体外重组好的DNA导入受体细胞,基础理论和技术的发展催生了基因工程,DNA是遗传物质的证明 DNA双螺旋结构和中心法则的确立 遗传密码的破译 基因转移载体的发现 工具酶的发明 DNA合成和测序技术的发明 DNA体外重组的实现 重组DNA表达实验的成功 第一例转基因动物问世 PCR技术的发明,1.以下说法正确的是
9、 （ ）A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列B、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接D、DNA连接酶使黏性末段的碱基之间形成氢键,C,练习,2.不属于质粒被选为基因运载体的理由是A、能复制 （ ）B、有多个限制酶切点 C、具有标记基因D、它是环状DNA,D,练习,3.有关基因工程的叙述中，错误的是（ ）A、基因工程技术能定向地改造生物的遗传性状，培育生物新品种B、重组DNA的形成在细胞内完成C、目的基因须由运载体导入受体细胞D、质粒都可作为运载体,B D,练习,5、下列说法正确的是：（ ）A、限制酶的切口一定是GAATTC
10、碱基序列B、质粒是基因工程中唯一的运载体C、重组技术所用的工具酶是限制酶、连接酶、运载体D、利用运载体在宿主细胞内对目的基因进行大量复制的过程可称为“克隆”,审题,6、下列黏性末端属于同种内切酶切割而成的是（ ）A、 B、 C、 D、,T C G A G C T T A A,A G G T T C C A,A G C T T CA G,A A T T CG,7、下列哪一种酶是基因工程的工具酶（ ）A、DNA连接酶 B、DNA酶C、RNA酶 D、运载体,记住了,2和7能连接形成ACGTTGCA； 4和8能连接形成GAATTCCTTAAG； 3和6能连接形成GCGCCGCG； 1和5能连接形成CT
11、GCAGGACGTC。,教材P7思考与探究 1,2.提示：迄今为止，基因工程中使用的限制酶绝大部分都是从细菌或霉菌中提取出来的，它们各自可以识别和切断DNA上特定的碱基序列。细菌中限制酶之所以不切断自身DNA，是因为微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，对于外源入侵的DNA可以降解掉。生物在长期演化过程中，含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵,3.提示：基因工程中作为载体使用的DNA分子很多都
12、是质粒，即独立于细菌拟核处染色体DNA之外的一种可以自我复制、双链闭环的裸露的DNA分子。是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢？其实不然，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件。 （1） 载体DNA必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才不至于因目的基因的插入而失活。 （2） 载体DNA必需具备自我复制的能力，或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制。 （3） 载体DNA必需带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。 （4） 载体DNA必需是安全的，不会对受体细
13、胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。 （5） 载体DNA分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。 实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。,基因操作的基本步骤,提取目的基因,目的基因是人们所需要转移或改造的基因。如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因，还有植物的抗病（抗病毒、抗细菌）基因、种子贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因、干扰素基因等。,目的基因与运载体结合,将目的基因导入受体细胞,目的基因的检测和表达,检测：通过检测标记基因的有无来判断目的基因是否导入。 表达：通过特定性状的产生与否来确定目的基因是否表达。,常用
14、的受体细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。,基因操作的基本步骤,目的基因导入受体细胞的方法 1、将细菌用CaCl2处理，以增大细菌细胞壁的通透性。 2、使含有目的基因的重组质粒进入受体细胞。 3、目的基因在受体细胞内，随其繁殖而复制，由于细菌繁殖的速度非常快，在很短的时间内就能获得大量的目的基因。,基因操作的基本步骤,基因操作的基本步骤,基因工程的成果与发展前景,基因工程与医药卫生,生产基因工程药品,用于基因诊断与基因治疗,基因工程与农牧业、食品工业,培育高产、稳产和具有优良品质的动植物新品种,培育具有各种抗逆性的动植物新品种,为人类开辟新的食物来源,基因工程与环境保护
15、,用于环境监测,用于被污染环境的净化,基因工程与医药卫生,我国生产的部分基因 工程疫苗和药物,1、基因工程药品的生产,微生物生长迅速，容易控制，适于大规模工业化生产。如利用大肠杆菌生产胰岛素、干扰素、白细胞介素2等。既增加产量，又降低成本。,基因工程与医药卫生,2、基因诊断,基因诊断是用放射性同位素(如32P)、荧光分子等标记的DNA分子做探针，利用DNA分子杂交原理，鉴定被检测标本上的遗传信息，达到检测疾病的目的。,生物芯片从正常人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出标准图谱。从病人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出病变图谱。通过比较、分析这两种图谱，就可以得出病变的DNA信息。基因芯片诊断技术以其快速、高效、敏感、经济、平行化、自动化等特点，将成为一项现代化诊断新技术。,基因工程与医药卫生,3、基因治疗,基因治疗是把健康的外源基因导入有基因缺陷的细胞中，达到治疗疾病的目的。,基因工程与农牧业、食品工业,生长快、肉质好的转基因鱼(中国),乳汁中含有人生长激素的转基因牛(阿根廷),基因工程与农牧业、食品工业,转黄瓜抗青枯病基因的甜椒,转鱼抗寒基因的番茄,基因工程与农牧业、食品工业,
