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1、利用带紫外线二极管阵列探测仪的反相高效液相色谱对在竹叶抗氧化剂(AOB) 强化食品中的黄酮C苷的鉴定摘要：利用带紫外线二极管阵列的反相高效液相色谱同时检测四种黄酮C-苷，即荭草苷、异荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷，而它们存在于一些应用竹叶抗氧化剂（AOB ）强化的食物系统（例如高温灭菌牛奶，向日葵籽油和压缩年糕）中。方法包括用甲醇水溶液提取竹叶抗氧化剂强化食品中的黄酮C苷，用饱和乙酸铅溶液和草酸钾除去其中的蛋白质，用n-己烷脱脂以及用带Phenomenex C18柱的固相萃取技术（SPE）来纯化。分析物用以乙腈和1% (v/v) 乙酸 (pH3.0) 为流动相的 Luna C18 5 m 250mm
2、4.6mm 柱分离。由于可重复性（相对标准偏差(RSD) 0.999)。而且， 探测最低浓度(LOD) 和量化最低浓度(LOQ) 都是用 统计学软件of Chemstation for 3D （美国 Palo Alto安捷伦技术）求得的。通过确定线性，量化限度和结果（如图2），最大纯度，重复性注射和恢复性证实了 HPLC 方法是有效的。对于定性效果，从保留时间和分析物最大纯度的精密度考虑可见此方法有更好的评价。用RSD测得样品和AOB 强化食品系列保留时间的可重复性都低于1（如下表3）表3：黄酮 C苷标准品和样品最大浓度的可重复性数据(ug/mL) a黄酮 C苷b 混合物样品最大浓度cS1 S
3、2 S3 荭草苷0.977 0.009 0.814 0.010 0.978 0.005 0.860 0.009 异红草苷0.983 0.008 0.840 0.015 0.979 0.004 0.869 0.019 牡荆苷0.978 0.004 0.922 0.010 0.910 0.016 0.973 0.003 异牡荆苷0.984 0.005 0.891 0.003 0.894 0.010 0.920 0.015 a对六种不同样品 (n = 6)的每个值都表示为方法 SD。 在重复性试验前黄酮 C苷标准溶液被稀释到 1ug/mL。三组空白样品的最大浓度都在混合黄酮C苷标准溶液的 1 ug/
4、mL处。b 四种黄酮 C苷的保留时间（方法 SD）是在整个重复性试验按以下：荭草苷, 11.210.05 min；异荭草苷 , 9.73 0.03 min； 牡荆苷 , 16.400.06 min；异牡荆苷17.20.03 min.求得的。cS1 =高温灭菌牛奶；S2 = 向日葵籽油；S3 = 彭化米饼最大纯度是 AOB 中四种黄酮 C苷表现出的主要四个尖峰中。没有一种情况是不纯的，也没有co-elutions 被观察到（对比因素98%）。方法的重复性对黄酮C苷标准溶液和AOB 强化食品分析物的结果都有了评价。包含了四种参考化合物的标准溶液(1 ug/mL) 被注射了 6次， RSD检测对保留
5、时间和总峰面积都是适合的。用SD获得四种黄酮C苷：荭草苷 (0.977 ug/mL) ，异荭草苷 (0.983ug/mL) ，牡荆苷 (0.978ug/mL) ，异牡荆苷 (0.984ug/mL) 的重复性都低于20ng/ml 。 相比较空白试验， i.e没有 AOB 强化的高温灭菌牛奶，向日葵籽油和彭化米饼，最大浓度在 1 ug/mL 也都注射了 6次来评价萃取过程的重复性，求得了每个因素的 SD值和平均值（表3）。为了评价一天内的重复性，分析AOB 强化样品用了最大浓度1 ug/mL ，结果如表 4所示：因为先前的研究没有对在三种食品系统中的四种黄酮C苷进行测验，所以选择1 ug/mL 作
6、为这些混合物的一个参照。用RSD测得在三种食品系统中的四种黄酮C苷的 81 98%的恢复性都低了4.6。这些结果符合了EU 法规定义的要求。黄酮C苷没有相当有效地从灭菌牛奶中萃取出来。牛奶成分的多样性和萃取方法的复杂性影响了整个从AOB 强化的牛奶中的萃取过程。与其他两种食品研究比较（表4），向日葵籽油中的黄酮C苷在最大浓度处有较好的恢复数据。因此，HPLC 法可认为是有选择的，正确且精确的。3. 4 AOB 强化样品的分析矩阵比较的标准曲线是用四种黄酮C苷强化了的原牛奶，向日葵籽油和彭化米饼在不同浓度绘得的。标准曲线结果如表5，且表现出在浓度范围内在330nm处有好的线性(r 0.995)
7、。表5：黄酮 C苷最大浓度样品的标准数据aSample 分析物线性趋势(ug/mL) 标准等式a相关因子 (R2) 高温灭荭草苷0.08 2.5 80.535C- 0.944 0.999 菌牛奶异荭草苷0.08 2 116.021C- 1.882 0.998 牡荆苷0.04 1.6 87.918C- 0.367 0.995 异牡荆苷0.04 1.6 103.358C- 0.348 0.996 向日葵荭草苷0.08 2.5 82.134C+ 0.934 0.997 籽油异荭草苷0.08 2 114.342C- 1.870 0.999 牡荆苷0.04 1.6 86.881C- 1.247 0.99
8、9 异牡荆苷0.04 1.6 102.447C+ 0.645 0.995 彭化荭草苷0.08 2.5 81.65 6C+ 1.442 0.998 米饼异荭草苷0.08 2 115.742C- 0.897 0.998 牡荆苷0.04 1.6 86.971C+ 1.145 0.994 异牡荆苷0.04 1.6 102.658C+ 0.457 0.996 a ：立方（ n=3）C：黄酮 C苷浓度（ ug/ml ）图4：二极管阵列探测的色谱图：(a):AOB强化的高温灭菌牛奶萃取物(b): AOB强化的向日葵籽油萃取物(c): AOB强化的彭化米饼萃取物A: 异荭草苷B: 荭草苷C: 牡荆苷D: 异牡
9、荆苷柱子：Luna C18. 流动相： : 1% (v/v)乙酸(pH 2.7)乙睛（梯度）流速： 1 mL/min 二极管阵列在 330nm处图4显示了强化的三种样品中四种黄酮C苷的色谱图。与其他两种食品分析中不同的是AOB 强化的牛奶色谱图在保留时间出现了一些不确定的尖峰。这些根据2.6.1不容易分离的未知混合物出现在了AOB 强化的牛奶萃取物中。幸运地是这些尖峰对分析的干涉可以忽略，因为这些杂质尖峰的保留时间不会覆盖四种黄酮C苷分析的尖峰。AOB 强化牛奶样品的分析对荭草苷， 异荭草苷， 牡荆苷和异牡荆苷按以下浓度进行：2.22ug/100mL (RSD = 4.73%, n = 6),
10、 5.87ug/100mL(RSD = 2.59%, n = 6), 2.37ug/100mL (RSD = 4.61%, n=6)and 2.10ug/100mL (RSD = 4.74%, n = 6)。（表 6）表6：在AOB 强化样品中的黄酮C苷 aAOB 强化样品黄酮 C苷荭草苷异荭草苷牡荆苷异牡荆苷总灭菌牛奶(ug/100 mL) 2.220.10 5.87 0.15 2.370.11 2.100.10 12.56 0.22 向日葵籽油 l (ug/100 mL) 201.082.09 425.642.68 51.841.23 202.521.34 881.085.05 彭化米饼(
11、ug/100 g干重) 327.438.16 676.8729.86 84.74.12 331.8311.42 1420.8334.66 a六种不同样品（n=6）每种表示为方法SD 另一方面， AOB 强化的向日葵籽油和彭化米饼色谱图显示清晰峰出现在相应的保留时间。，在整个 HPLC分析中几乎没有发现杂质峰。这个结果表示相对于AOB 强化的牛奶，这两种AOB 强化食品的预处理和萃取方法是切实可行和有效的。此外，这两种AOB 强化食品的分析浓度在表 6中可见。根据EU法规，对于样品验证方法的精确性应该在80 110%，在研究中用符合法规要求的1.0 4.6%的RSD测得恢复性是81 98%。3.
12、 5 结论这样试验记述了对在AOB 强化食品中的黄酮C苷量化的 HPLC 方法。应用极性endcapped Luna C18柱可以不用离子偶试剂就能使四种分析物分离。没有观察到柱子破坏问题。用符合EU法规的量化限度分析四种黄酮 C苷，这种方法足够灵敏，对于荭草苷，异荭草苷，牡荆苷和异牡荆苷可以获得极好的正确性和精确性。至于重复性（相对标准偏差(RSD) 2.2% ）和恢复性(81.4 91.8%)也得到了好的结果。在AOB 强化的灭菌牛奶，向日葵籽油和彭化米饼中四种黄酮C苷的总浓度分别是12.56 ug/100 mL, 881.08ug/100mL和干重 1420.83ug/100 g （表 6）。这个方法成功地应用于AOB 强化样品中的黄酮C苷分析。优化的程序也可以为其他强化食品中黄酮C苷分离作参考。以后的研究工作将是扩充其他食品矩阵 和水样品的方法学。
