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1、分子生物学研究方法和技术,本人基本情况,1984年获湖南农学院农学学士学位。1987年获中国科学院遗传研究所理学硕士学位，专业:分子遗传。 1999年11月-200年11月 受国家科技部派遣，在日本农林水产省北海道国家农业研究中心博士后特别研究员；主要从事基因定位和功能基因的筛选。 年：主要从事水稻细胞质雄性不育机理研究；水稻分子育种技术研究。 4：主要从事杂交水稻种子纯度快速鉴定技术研究；水稻品种指纹研究；基因定位和分子育种技术研究。,1、分子生物学的发展历程 1871年，首次发现DNA（鲑精DNA）。 1943年，证明DNA为遗传分子，而不是蛋白（1944，O T Avery） 1953年
2、，DNA双螺旋模型提出（J D Watson（美）和F H C Crick（英），1962年或诺贝尔生理学、医学奖）。从而为分子生物学这一学科奠基。 1961年，合成mRNA，破译第一个遗传密码（M W Nirenberg（美），1968年获诺贝尔生理学、医学奖） 基础研究的创新，与推动人类文明的进步。 （以上被称为理论上的三大发现）,1970年，分离出第一个限制性内切酶（W Arber（瑞士），1978年获诺贝尔医学奖） 1970年，Baltimore和Temin发现了逆转录酶 长期的基础研究积累迎来了突飞猛进的高潮。 1973年，Cohen把质粒作为基因工程的载体使用 基础研究向应用研究的
3、拓展。 （以上被称为生物工程技术的的三大发明）,3个事例： （1）1976年，重组DNA成功（H Boyer和S N Colen，1981年获诺贝尔化学奖）勇敢的科学精神。 （2）1982年，美国一制药公司在2000升发酵液中提取出100克精制胰岛素。相当于从1600磅动物胰腺中的提取量效率、成本、质量、竞争。 （3）荷兰最早把分子生物学产品“猪牛痢疾疫苗”投放市场，比以上美国的胰岛素早半年后来居上。,人类对生命现象的认识,20世纪 个体 染色体 基因 DNA SNP 生物与非生物间的界限消失了！21世纪基因克隆，拼结 组装植物、动物、婴儿！,数、理、化相关学科,生物学实验技术,渗透 交叉,近
4、代生物学,个性,共性,宏观生物学 （生态学为核心）,微观生物学 （分子生物学为核心）,细胞水平,分子水平,结构生物学，发育生物学，神经生物学等新兴学科发展,生物多样性 研究,资源保护与 利用,人类生态环境的保护 工农业生产持续发展,现代生物学的发展,分子生物学,分子生物学的延伸,2 分 子 生物 学 的 概 念,2.1 分子生物学的定义 2.2 分子生物学的三大原则 2.3 分子生物学研究的三大主要领域 2.4 分子生物学发展的三大支撑学科,2.1 分子生物学的定义,Molecular biology is the study of genes and their activities at
5、the molecular level, including transcription, translation, DNA replication, recombination and translocation. 分子生物学是研究核酸、蛋白质等生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规律性和相互关系的科学，是人类从分子水平上真正揭示生物世界的奥秘，由被动地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础学科。,分子生物学与生物化学之间的关系与区别,分子生物学研究生物大分子的结构、功能及信息传递过程，从分子水平研究生命现象。,生物化学生物体内的化学运动，包括化学组成、变化、结构与功能，生物分子间的物
6、质与能量转换过程。,分子生物学生物化学, 构成生物大分子的单体是相同的, 生物遗传信息的表达的中心法则相同,高级结构,生物大分子之间的互作,2.2 分子生物学的三大原则,共同的核酸语言 共同的蛋白质, 生物大分子单体的排列（核苷酸，氨基酸）,结 构 生 物 学,基因分子生物学,生物技术理论 论与应用,2.3 分子生物学研究的三大主要领域,狭义的分子生物学分子遗传学,2.4 分子生物学发展的三大支撑学科,1839-1847年 Matthias Schleiden & Theodor Schwann,细胞的化学组成，细胞器的结构，细胞骨架，生物大分子在细胞中的定位及功能,分子生物学发展的三大支撑学
7、科之一,Gregor Mendel1864 年,Genetics,Molecular Genetics,Gene structure Gene duplication Gene expression Gene recombination Gene mutation,分子生物学发展的三大支撑学科之二,遗传因子假说,Genetics,Biochemistry,Nucleic Acid Chemistry,Protein Chemistry,Enzymatic nature of crystalline （晶体） Protein,Biochemistry,3 21 世 纪 分 子 生 物 学 展 望
8、,3.1 自然科学历史舞台角色的重大变化 3.2 未来生物学形成的新热点及领域 3.3 应用生物学发展 3.4 21世纪 生命科学的世纪,引导自然科学向物质运动最高层次突破的带头学科,3.2 未来生物学形成的新热点及领域,生物大分子的高级三维结构与功能的统一,生物大分子之间的互作,个体,细胞,分子,整体论,细胞中的定位,细胞分化,神经基质 神经通道 信息传递,计算机语言,分辨，提取，分析， 比较， 预测生物信息,生物大分子的结构与功能信息,基因的识别与鉴定,基因功能信息的提取与证实,基因表达谱的绘制 (microarray),蛋白质水平上基因互作的探测,3.3 应用生物学发展,生物技术,诊断试
9、剂 治疗药物 植物品种 环境工程 食品加工 生物塑料 废物处理 再生能源 ,3.4 21世纪 生命科学的世纪,二十一世纪 生命科学的世纪,学习分子生物学的意义,第一章 RNA的分离纯化,主要内容,前言 一、核酸分离、纯化原则 （一）保持核酸分子一级结构的完整性 （二）防止核酸的生物降解 二、分离提取核酸的主要步骤 （一）细胞的破碎 （二）核蛋白的解聚、变性蛋白的去除 （三）核酸的沉淀(四）核酸的浓度测定 （五）核酸的保存,核酸（nucleic acid）是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础。无论是进行核酸结构还是功能研究，首先需要对核酸进行分离和纯化。核酸样品质量将直接关系到实验的成败。,
10、前 言,一、核酸分离、纯化原则,（一）保持核酸分子一级结构的完整性1 意义遗传信息全部储存在一级结构之中，核酸的级结构还决定其高级结构的形式以及和其他生物大分子结合的方式。2 分离核酸原则：1）温度不要过高；2）控制一定的pH值范围(pH值5-9); 3）保持一定的离子强度; 4）减少物理因素对核酸降解的机械剪切力.,（二）防止核酸的生物降解,细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂。,1. DNA酶抑制剂,1） 金属离子螯合剂：DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用金属二价离子螯合剂，
11、可抑制DNA酶活性。如EDTA-Na2(乙二胺四乙酸二钠)、8-羟基喹啉； 2） 阴离于型表面活性剂：如SDS，该试剂除对核酸酶有抑制作用外，还能使蛋白质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷的复合物，该复合物在高盐溶液中沉淀。,2. RNA酶（RNAase)抑制剂,RNAase分布广泛，极易污染样品，而且耐高温、耐酸、耐碱，不宜失活。 (1) 皂土（bentonite ）作用机制：皂土带负电荷，能吸附RNase，使其失活。,(2) DEPC(二乙基焦碳酸盐) (C2H5OCOOCOOC2H5)粘性液体，很强的核酸酶抑制剂。作用机制：与蛋白质中His结合使蛋白变性。使用注意：1）DEPC也能破坏单链
12、核酸中大部分腺嘌呤环。但浓度比使蛋白质变性的浓度大1001000倍。2）容易降解，保存在4 或液氮中；3）提RNA时，0.1% DEPC浸泡器皿37 2 h。4）剧毒。,（3) 肝素 （4）复合硅酸盐（Macaloid) （5）RNase阻抑蛋白（RNasin） （6）氧钒核糖核苷复合物 (Vanadyl-Ribonucleoside Complex, VRC),二 分离提取核酸的主要步骤,（一）细胞的破碎1 高速组织捣碎机捣碎2 玻璃匀浆器匀浆3 超声波处理法4 液氮研磨法5 化学处理法(SDS、吐温80等）6 生化法（溶菌酶、纤维素酶等）,（二）核蛋白的解聚、变性蛋白的去除核酸与蛋白质的结
13、合力主要是正负静电吸力(核酸与碱性蛋白的结合)、氢键和非极性的范德华力。分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合的蛋白质分开，同时避免核酸降解。,常用方法：1. 加入浓盐溶液（如NaCl）核酸-蛋白质加入NaCl后，破坏静电吸力，使氢键破坏，核蛋白解聚；2. 加入SDSSDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，还具有使核酸从蛋白质上游离出来的功能；,3 . 酚/氯仿抽提酚氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并对核酸酶有抑制作用。氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减少残留在水相中的酚，同时氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。在酚/氯仿抽提核酸提取液时，需要振摇，为防止起泡和促使水相与有机相的分离，再加上一定量
14、的异戊醇（酚：氯仿：异戊醇=25：24：1）。,1）使用注意酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈现粉红色或黄色，表明其中含有酚的氧化产物，例如醌、二酸等。变色的酚不能用于核酸抽提实验，因为氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。2）安全操作酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操作时应戴手套。,使用酚时应注意,（三）核酸的沉淀,沉淀是浓缩核酸最常用的方法。优点：改变核酸的溶解缓冲液；重新调整核酸的浓度；去除溶液中某些盐离子与杂质。,1. 核酸沉淀的盐类及浓度,2. 有机沉淀剂,（1）乙醇 优点：对盐类沉淀少，沉淀中所含迹量乙醇易挥发除去，不影响以后实验。 缺点：需要量大，一般要求低温操作。,（2）异丙醇,优
15、点：需体积小，速度快，适于浓度低、体积大的DNA样品沉淀。一般不需低温长时间放置。 缺点：易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀异丙醇难以挥发除去。所以，最后用70乙醇漂洗数次。,（3）聚乙二醇（PEG）,优点：可用不同浓度的PEG选择沉淀不同相对分子质量的DNA片段。应用6000相对分子质量的PEG进行DNA沉淀时，使用浓度与DNA片段的大小成反比。 注意：PEG沉淀一般需要加入0.5mol/L的NaCl或10mmol/L的MgCl2。要除去DNA沉淀中PEG。,（4）精胺,精胺不是有机溶剂，但可快速有效沉淀DNA。原理是：精胺与DNA结合后，使DNA在溶液中结构凝缩而发生沉淀，并可使单核苷酸和蛋白质
16、杂质与DNA分开，达到纯化DNA的目的。,3. 核酸沉淀的温度和时间,一般强调，核酸沉淀在低温长时间下进行。低温长时间沉淀，易导致盐与DNA共沉淀，影响以后的实验。一般使用0冰水，10-15min， DNA样品足可达到实验要求。,(四）核酸的浓度测定,1. 紫外分光光度法测定DNA和RNA的含量前提：核酸样品要较纯，无显著蛋白质、酚、琼脂糖及其他核酸污染。测定浓度应大于0.25 g/ml 。结论：在波长260nm紫外光下，1 OD值的吸光度相当于双链DNA浓度为50g/ml；单链DNA为37 g/ml；RNA为40 ug/ml。,紫外分光光度计测定核酸浓度的操作步骤,a吸取一定量的DNA样品或RNA样品，加水至特定体积后，转入分光光度计的石英比色杯中。 b分光光度计先用一定量的水校正零点。 c测定待测样品在230nm、260nm和280nm的OD值。 d计算浓度。双链DNA样品浓度(g/l) = OD260核酸稀释倍数 50； RNA样品浓度(g/l) = OD260核酸稀释倍数40。 e分析纯度。,
