《大鼠骨髓间充质干细胞骨向分化及体外诱导实验》由会员分享，可在线阅读，更多相关《大鼠骨髓间充质干细胞骨向分化及体外诱导实验（10页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 710004)摘要：目的 建立骨髓间充质干细胞(MSCs)体外分离培养体系，进行骨向分化诱导，并将诱导的成骨细胞复合钛网体外成骨，为 MSCs 进一步的临床应用研究提供实验依据。方法 用密度梯度离心法分离大鼠骨髓 MSCs，并对其形态学特征进行观察。用诱导剂对 MSCs 向成骨细胞进行诱导分化，并进行形态学观察和免疫细胞化学检测。用扫描电镜观察骨向诱导后细胞复合钛网的情况。结果 用密度梯度离心法成功分离获得了高纯度的骨髓 MSCs。经骨向诱导后，ALP 和矿化结节染色阳性。扫描电镜可观察到骨向诱导后细胞复合在钛网表面有矿化的基质沉积。结论 成功建立了大
2、鼠骨髓MSCs 体外分离和培养体系，MSCs 能够向成骨细胞分化，骨向诱导后细胞复合钛网体外有矿化的基质。关键词：骨髓间充质干细胞;细胞培养; 骨向分化;钛网; 组织工程An experimental study of osteogenic differentiation andinducted in vitro of SD rat bone marrow stem cellYao Tianhua, Li Xiaohong, Xiong Xizhou, Rao Guozhou, Shi Jianfeng, Li Ang(Department of Research Center for Sto
3、matology, KKME-专业医学搜索引擎 http:/ Hospital, Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710004, China)ABSTRACT: Objective To establish an isolation and culture system of rat bone marrow stem cells(MSCs), osteogenic differentiation and compound titanium meshes in vitro in order to verify their oste
4、ogenesis. Methods Density gradient centrifugation was used to isolate bone MSCs from SD rats and their morphological characteristics were examined under microscope. The bone MSCs underwent osteogenic induction and cytochemical and immunocytochemical staining were performed to verify their multipoten
5、tial. Cells of osteogenic differentiation that compounded titanium meshes were detected by scanning electron microscope. Results High purity of bone MSCs was successfully obtained and they showed good proliferation ability. Both ALP activity and mineraliztion node staining were positive in bone MSCs
6、 after osteogenic differentiation. Cells of osteogenic differentiation that compounded titanium meshes were detected by scanning electron microscope, it was deposited calcified matrix. Conclusion The isolation and culture system of rat bone MSCs was successfully established and the bone MSCs sustain
7、ed their osteogenic differentiation potential in vitro. The cells of osteogenic differentiation that compounded titanium meshes was deposited calcified matrix.KEY WORDS: bone marrow stem cells; cell culture; KKME-专业医学搜索引擎 http:/ differentiation; titanium meshes; tissue engineering骨髓间充质干细胞(marrow ste
8、m cells, MSCs)是骨髓中除造血干细胞以外的另一类干细胞类型，不但能增殖，在特定培养条件下还能实现跨系统分化。大量实验表明在体外可分化为成骨细胞、成软骨细胞等组织细胞1。由于其取材方便，易于体外分离培养扩增，且自体获取回输后不会发生免疫排斥反应，基因转染效率高，转染后稳定表达，因此骨髓 MSCs 被认为是组织工程和基因工程的重要种子细胞。本研究在总结以往研究的基础上，紧密结合临床，探索有关骨髓 MSCs 诱导分化为成骨细胞和钛网复合成骨细胞体外成骨，旨在探讨成骨细胞钛网移植物成骨的可行性。1 材料与方法1.1 主要材料及实验仪器 SD 大鼠( 西安交通大学医学院动物实验中心)、LG(
9、低糖)DMEM 培养液(GIBCO)、胎牛血清(FBS)(GIBCO)、地塞米松 (GIBCO)、 甘油磷酸钠(GIBCO)、抗坏血酸(GIBCO)、胰蛋白酶 (1300)(GIBCO)、1.077103g/L 淋巴细胞分离液(上海恒信化学试剂有限公司)、商用纯钛网(西北有色金属研究所) 、JSM840 型扫描电镜(西安交通大学医学院电镜室)。1.2 骨髓 MSCs 体外分离和培养 取 4 周龄 SD 大鼠，无菌条件下取出胫骨和股骨，剪去骨骺端，用 LGDMEM 培养液冲出骨髓，离心收集细胞。将细胞制成细胞悬液，加入含等量淋巴细胞分离液的试管中，以 800g30min 离心，吸取界面白膜层细胞
10、，培养液清洗，1.0108/L 接种于培养瓶中， 37 ，50mL/L CO2 的培养箱KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 后更换培养液，以后每周换液 2 次。10-14d 后待细胞达到 70%-80%融合时，用 2.5g/L 的胰蛋白酶消化，传代。1.3 骨髓 MSCs 诱导 取第三代骨髓 MSCs，按 5107 /L 的细胞密度制备细胞爬片，培养 3d 贴壁后进行诱导。骨向诱导液为含10%(体积分数)FBS ，100mg/L 青霉素，100mg/L 链霉素，110-7mol/L 地塞米松，10mmol/L 甘油磷酸钠，50g/L 抗坏血酸的LGDMEM 培养液。每 4d 换液一次，共
11、诱导 2 周。1.4 鉴定 碱性磷酸酶(ALP)染色： 采用钙钴法 ALP 染色。分别选取骨向诱导 1、2 周的骨髓 MSCs 爬片，PBS 洗涤后进行染色，显微镜下观察照相，黑染细胞为阳性细胞。以未诱导的细胞作为对照。VonKossa 染色：分别选取骨向诱导 1、2 周的骨髓 MSCs 爬片行 VonKossa 染色，黑色的部位即为矿化结节。以未诱导的细胞作为对照。1.5 钛网的制备 将商用纯钛网制成厚 1mm 直径 8mm 的圆盘形薄片，320#耐水砂纸打磨光滑，75%(体积分数)乙醇清洗，三蒸水清洗 3 遍，高温高压消毒备用。1.6 钛网与成骨细胞复合物的体外成骨 取两块 6 孔培养板，
12、各加入 1 片钛网，将第 3 代骨髓 MSCs 消化制成均匀的细胞悬液，使其细胞浓度为 4107/L，接种 6 孔作为阴性对照组 ;将骨向诱导14d 后的第 3 代骨髓 MSCs 消化制成均匀的细胞悬液，使其细胞浓度为 4107/L，接种 6 孔作为实验组，每孔分别加入 2mL LGDMEM 培养液，37 ，50mL/L CO2 孵箱内培养。KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 扫描电镜(SEM)观察钛网表面矿化情况 分别在培养的7d 和 14d，取实验组、阴性对照组和阳性对照组各 3 孔，吸去原液，0.01mol/L PBS 清洗 3 遍，2.5%(体积分数)戊二醛前固定，1%(体积分数
13、)OsO4 后固定，梯度乙醇脱水，临界点干燥，离子溅射仪喷金，SEM 观察钛网表面矿化的情况。2 结果2.1 细胞形态学观察 骨髓 MSCs 原代细胞 4d 时，多数细胞已贴壁，细胞以小角形、梭形多见，胞核位于中央，细胞间夹杂少量有核的淋巴细胞，红细胞极少见。第一次换液后，细胞为典型的长梭形，并呈集落生长，平行状或旋涡状排列，有一定的极性。传代以后，细胞以长梭形、多角形细胞为主，可见 1-3 个核仁，其中扁平的多角形细胞内细胞骨架结构清晰可见，杂质细胞极少见。一般 10-14d 便可达 70%-80%融合(图 1)，进行传代。诱导生成的成骨细胞由骨髓 MSCs 的纺锤形或梭形变为立方形三角形、
14、多角形，细胞数目多时可以叠层生长。图 1 MSCs 原代培养 12d，细胞呈梭形、多角形( 略)Fig.1 The primary cultured MSCs for 12 days, cells appear polygonal or spindlelike shape(100)2.2 钙钴法碱性磷酸酶染色结果 骨髓 MSCs 在骨向诱导 7d后，部分细胞表现为 ALP 染色阳性，胞浆红染，细胞界限清楚(图2a);而未经诱导的对照骨髓 MSCs,则表现为阴性表达或弱阳性表达。骨髓 MSCs 经骨向诱导 14d，多数细胞表现为 ALP 染色强阳性，胞KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 2
15、b);而未经诱导的对照组细胞无明显变化，表现为弱阳性。2.3 VonKossa 染色结果 骨髓 MSCs 经骨向诱导 7d，可见少量细胞呈簇状生长，未见明显的细颗粒状结构(图 3a)。经骨向诱导 14d，可见细胞呈密集重叠生长，无接触抑制性。细胞外基质出现较多散在致密圆形或不规则形态的细颗粒状结节，无细胞结构，结节周围的细胞密度较高，轮廓不清，结节中心透光性差。经AgNO3 染色呈黑色，证实为矿化结节，周围细胞也可轻微红染，细胞核红色(图 3b)。而未经诱导的对照组细胞虽密集重叠生长，但不形成矿化结节，表现为阴性。2.4 钛网复合成骨细胞复合物的体外矿化情况 扫描电镜结果显示，实验组在培养 7d 时钛网表面未见明显细颗粒状结构(图 4a)，在培养 14d 时钛网表面可见许多大小不一、形态不规则的颗粒状结节(图 4b)。阴性对照组在培养 7d 和 14d 时钛网表面未见明显改变。图 2 MSCs 骨向诱导后的碱性磷酸酶表达( 略)Fig.2 The expression of alkaline phosphatase after the MSCs osteogenic inducted (Gomori staining 40)a:
