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1、生物工程下游技术复习题一、 基本知识点1、经典的蛋白质测定方法有 凯氏定氮法、TCA 比浊法、福林-酚法和紫外法。2、蛋白质分子是含有可带正电荷的氨基、亚氨基、酰氨基等和可带负电荷的羧基、苯酚基、巯基等的两性生物大分子。3、色谱柱是进行色谱分离的主要场所。4、色谱，从基质材料的角度来看，可以分为有机基质和无机基质。5、目前常见的液相色谱填料，按其物理形态，一般分为多孔型、非多孔型和薄壳型三中结构类型。6、等电聚焦法可以测定蛋白质的等电点，同时又能鉴定蛋白质的纯度。7、天然人白细胞介素-2（IL-2）由 133个氨基酸组成，其中有一个游离半胱氨酸（位于第 125位） ，而第 58位和第 105位
2、的半胱氨酸形成二硫键，此二硫键为活性所必须，而二硫键的错配对，可降低其生物活性和形成抗原性。8、带有正电荷的蛋白质分子在电场作用下，向阴极移动。9、径向色谱应用于生化分离，具有快速、压降低两个明显的优势。10、羟基磷灰石晶体是骨骼和牙齿等生物体硬组织的主要无机成分，它与生物体组织有特异的亲和力和相容性。11、肽谱技术是指蛋白质被酶解或化学降解后肽段的分离分析和制备。12、高速珠磨法中，影响珠磨破碎的操作参数有转速、进料速度、珠子直径与用量、细胞浓度、冷却温度等。13、超声破碎的效率与声频、声能、处理时间、细胞浓度及菌种类型等因素有关。14、空化现象是在强声波作用下，让气泡形成，胀大和破碎的现象
3、。15、切向流过滤又称错流过滤、交叉流过滤、十字流过滤， （cross-flow filtration）就是一种维持恒压下高过滤速度的技术。16、离子交换法按照其操作方式可以分为间隙式分批操作及柱式洗脱两种。17、在膜分离过程中，浓差极化与膜污染是经常发生存在的两种现象，也是影响膜分离技术在某些方面应用的拦路虎。18、泡沫分离技术是一种基于溶液中溶质（或颗粒）间表面活性的差异进行分离的一种方法，表面活性强的物质优先吸附于分散相（气体）与连续相（液面）的界面处，被气泡带出连续相而达到浓缩。19、膜分离技术具有设备简单、操作方便、无相变、无化学变化、处理效率高和节省能量等优点，已作为一种单元操作日
4、益受到人们极大重视。20、可依在分离时一次进样量的多少，将色谱分为分析色谱（10mg） 、中等规模制备色谱亦即半制备色谱（10-50mg） 、制备色谱（0.1-1g）和工业生产规模色谱（大于 20g/d）4 大类。21、离子交换色谱，按所使用的离子交换剂可分为，强阴离子、强阳离子、弱阴离子、弱阳离子交换方式。22、在色谱单元纯化条件的最优化中，首先解决的问题是要对所用的色谱柱的种类进行选择，这取决于试样和目标产物的性质。一般来说，期望目标产品尽可能多的保留，而杂蛋白不保留，因此需选择目标产品与固定相作用力强、廉价的色谱柱。23、色谱和电泳是目前所知最好的两种分离方法。其理论塔板数可达百万数量级
5、。24、基质材料（或称载体）是色谱填料的支撑骨架，它直接决定了填料的颗粒大小与分布、颗粒强度、孔径大小与分布、孔结构形态、颗粒内部的化学结构与其稳定性等，也直接影响到对颗粒表面（包括内孔表面）化学修饰方法的实施。25、基质包括细胞生长所需各种营养成分，其消耗主要有三个方面：一是细胞的生长，合成新的细胞；二是细胞维持生命要消耗能源物质；三是合成次级代谢产物。26、径向色谱：是采用了径向流动技术，样品和流动相沿径向流动，而不是如传统色谱柱（既轴向色谱）样品和流动相是从柱的一段流向另一端。流动相和样品可以从色谱柱的周围流向柱圆心，也可以是从色谱柱圆心流向柱的周围的一种色谱技术。27、全交换容量：指每
6、克干介质或每毫升湿介质具有的功能基的含量。28、工作容量：也称有效容量，是指每克干介质或每毫升湿介质在一定操作条件下交换吸附蛋白质的实际容量。29、有效柱长：溶质从开始迁移至其迁移速度等于流动相速度时，溶质在色谱柱上迁移的距离成为有效迁移距离，也成为有效柱长。30、最短柱长：混合溶质中使一对最难分离的溶质 1和溶质 2的分离度Rs=1时所需的最短长度。31、氨基酸分析可以分为 柱后反应法 和 柱前衍生法 两大类。32、柱的填充目前主要采用干法和湿法两种33、生物反应器变量的控制除了设备值要由工艺及动力学优化确定以外，具体实施要靠 3个部分：测量装置、控制器和执行器。34、在动物细胞培养系统中有
7、许多因素限制了细胞生长。限制细胞密度的主要因素是培养条件和最优控制。两个关键是细胞代谢物（乳酸、氨等）毒害和营养物质的耗竭。35、无论是贴壁细胞还是悬浮细胞，就操作方式而言，深层培养可分为分批式、流加式、半连续式、连续式、和灌注式 5种方式。36、目前，径向色谱柱使用的填料主要有离子交换树脂和亲和色谱型两种。37、蛋白质的生物活性与其长链的结构有很大关系，外界条件的变化（如温度、溶液离子强度、pH 值、有机溶剂等）都会影响它的三维空间结构，严重时使三维结构破坏而发生“变性” ，有事就复活不了。38、吸附过程主要分为两大类：化学吸附和物理吸附39、蛋白质的化学分析技术主要有 色谱、电泳、质谱技术
8、等。40、贴壁依赖型动物细胞在微载体表面增殖，可分为贴壁、生长和扩展成单层 3个阶段。41、测定蛋白质的以及结构的主要方法有：蛋白质化学方法（主要是 Edman降解法测定 N端和用羧肽酶或化学法从 C端测起）和从 cDNA演绎的方法。其它方法有质谱法和二维核磁共振法。42、电泳系统中影响冷却的有以下三个因素：冷却面积、热传递系数、热传递的推动力-温差。43、凝胶过滤的骨架主要分为天然多糖类及合成大分子两大类。44、通气系统的基本形式有浸没式鼓泡器、表面通气装置和膜反应器。45、流体流动性质依其切变速率与剪切力之间的关系可分为牛顿型流体和非牛顿型流体。46、目前常用的鉴定蛋白质纯度方法有 聚丙烯
9、酰胺凝胶电泳和 SDS-PAGE、毛细管电泳、等电聚焦、HPLC 等。47、径向色谱柱填料的形态可以分为颗粒、膜和连续床层 3种。48、制备羟基磷灰石的方法通常有干法、水热法和湿法。49、空间排阻色谱（SEC）方法按其淋洗体系通常分为两大类，既水相 SEC和有机相 SEC。50、凝胶过滤是利用凝胶的网状结构根据分子大小进行分离的一种方法。51、双向凝胶电泳的分辨力很高，比如细胞中的蛋白质能用双向电泳分辨成2000-3000个点，而在色谱和毛细管电泳中，一般只能分辨上百个峰。52、带有负电荷的蛋白质分子在电场作用下向阳极移动。53、任何两种不同的物质，只要它们存在有不同的物理、化学或生物学性质上
10、的差异，且这些差异还可表现于在不同物相上分配系数的差异，他们便可以在色谱分离中得到分离、分析或测定。54、生物反应器常用的控制方法是反馈调节55、高压均浆法所用设备是高压匀浆器，它基本上由高压泵和匀浆阀组成。56、正向色谱：色谱技术中，当固定相极性大于流动相极性时，称之为“正向”色谱。反向色谱：色谱技术中，当固定相极性小于流动相极性时，称之为“反向”色谱。57、离子交换法：是通过带电的溶质分子与离子交换剂中可交换的离子进行交换而达到分离纯化的方法。58、线性色谱：在色谱学中，如果流动相中样品的浓度与固定相中样品的浓度之间呈线性关系，那么在这种情况下的色谱分配过程就称为线性色谱。59、非线性色谱
11、：在色谱学中，如果流动相中样品的浓度与固定相中样品的浓度之间不存在线性关系，而是出现其他的函数关系，那么相应的色谱分离过程就称为非线性色谱。60、吸附等温线：是指在一定温度下物质分子在两相界面上进行的吸附过程，达到平衡时他们在两相中浓度之间的关系。61、文献上常见的发酵罐比拟放大法仍以近似法则与因次分析的结合为主。二、 综合知识点1、硅胶的化学修饰和改性硅胶本身只能充作正向色谱填料，它必须经过种种化学修饰或改性，才能改变其表面的化学性质，成为适用于不同分离模式的色谱填料。1、 表面硅羟基的化学修饰硅可以与诸多元素形成稳定的共价键，这是形成品种繁多的含硅化合物已经硅胶进行化学修饰的基础。硅羟基的
12、化学修饰通常采取以下三种途径：通过氯化反应：除去了物理吸附水的硅胶，可以将硅羟基转化为活泼的表面硅氯基。通过氯硅烷与硅羟基的反应通过氯硅烷可以将各种烷基链引入硅胶表面，特别是引入长链正烷基链或芳香基以制备反向固定相。通过烷氧基硅烷与硅羟基的反应烷氧基硅烷与硅胶额可以进行缩合反应，使硅胶表面带上环氧基或氨基等官能团，在此基础上可以很方便的进一步进行反应或修饰。2、 包敷与涂层可以通过不同的途径以制备稳定的聚合物涂层，也可以将含双键的聚合物涂于硅胶表面，使其表面带上双键。令其与随后涂敷上去的第二单体进行共聚，便可在硅胶表面上形成致密的聚合物膜。3、 整体修饰所谓整体修饰，指的是利用不同官能团的卤代
13、硅烷或烷氧基硅烷的水解、缩聚反应，以直接制出空间交联型、含不同 R基的硅胶。4、 硅烷化试剂硅胶的化学修饰方法中，表面硅羟基的修饰仍然是主要的途径，所使用的组要试剂是各种取代硅烷，既硅烷化试剂。氯硅烷是常用的硅烷化试剂，但它有一些很明显的缺点。相比之下烷氧基硅烷对环境和人体的危害性要小的多。2、蛋白质工程中，常用的蛋白质复性方法蛋白质工程中常会遇到包含体问题，包含体基本是由蛋白质组成，其中大部分是克隆表达的产物，这些产物在一级结构上是正确的，但在立体构型上却是错误的，因此没有生物学活性。因此要涉及到蛋白质复性问题。蛋白质的复性主要有以下几种方法：1、 稀释复性与透析复性使蛋白质最常用的有两种方
14、法。一种方法是将溶液稀释，导致变性剂浓度降低，蛋白质开始复性。另一种方法是用透析、超滤或电渗析除去变性剂。2、 色谱复性色谱复性的方法很多，且原理各不相同，依据其抑制凝聚的特点，将其分为两大类。一类是以凝胶过滤为代表的非吸附型色谱复性。另一类是吸附型色谱复性，其中常用的吸附色谱复性包括金属螯合色谱复性、亲和色谱复性、离子交换色谱复性、疏水相互作用色谱复性等。凝胶过滤是通过分子筛效应将变性蛋白质与变性剂分离，从而使变性蛋白质进入复性溶液进行复性。金属螯合色谱复性主要是针对 Histine tag（组氨酸标签）的基因工程蛋白质。将含有带组氨酸标签蛋白质的裂解液流过含有镍的亲和层析柱，组氨酸就可以与
15、镍螯合从而结合在柱子上，而裂解液中其他蛋白质由于没有组氨酸标签而直接流出柱子，从而达到分离目的。亲和色谱复性是利用抗原抗体相互作用、酶与底物相互作用或其他特异性相互作用帮助蛋白质复性。其它吸附色谱复性方法。离子交换色谱、疏水作用色谱等色谱技术，通过选择合适的条件，溶解了的包含体可以通过各种作用达到复性。3、微囊化动物细胞及其应用目前微囊化细胞可以在两方面应用，意识培养微囊化动物细胞以生产一些药物；二是作为药物直接用于治疗或作为筛选药物之用。一、 生产药物上的应用1、 单克隆抗体的生产微囊化哺乳动物的主要应用是单克隆抗体的生产。微囊工艺已生产以克计的单克隆抗体。2、 高值生化药物的生产一些生化药
16、物的生产，总生产率可达培养瓶生产的 5被以上。而且，产物在电泳上显示纯度明显高。3、 干扰素的生产通过对一些培养生产干扰素发现，细胞在微囊中生长比悬浮胖或单层培养更旺盛。二、 在治疗及药物筛选上的应用1、 人工器官微囊化动物细胞在排除免疫反应上可能有普遍意义。人们已将某些器官的细胞微囊化并植入体内以期待能代替这些器官的功能。2、 抗癌药物的筛选微囊化的肿瘤细胞用于估价抗癌药物对活体的作用。人的肿瘤细胞经微囊化后注入小鼠腹腔中，服用受检的抗癌药，检测微囊化的肿瘤细胞对药物的反应，结果发现抗癌药能穿透微囊的膜作用于微囊中的肿瘤细胞，抑制和杀灭的水平与其他体外和体内测定的药效一致。4、同无机基质的填料相比较，有机高分子类型填料的普遍特征同无机基质的填料相比，有机高分子类型填料普遍具有如下特征：它们的基质微球可以广泛选择各种天然的多糖为原料来制备，也可以广泛使用各种的单体和交联剂来制备。这些高分子材料一般都容易进行化学改性处理，所得到的填料普遍具有良好的色谱选择性。它们对于被分离样品有较强的负载能力，有
