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1、第三讲 生物信息学常用软件 及其使用,一、DNA 序列片断拼接 （电子基因克隆）,获得感兴趣的EST，在dbEST数据库中找出EST的最有途径是寻找同源序列，标准：长度100bp，同源性50%以上、85%以下。 然后将检出序列组装为重叠群（contig），以此重叠群为被检序列，重复进行BLAST检索与序列组装，延伸重叠样系列，重复以上过程，直到没有更多的重叠EST检出或者说重叠群序列不能继续延伸，有时可获得全长的基因编码序列。 再与GeneBank核酸数据库进行相似性检测，假如有精确匹配基因，将EST序列数据据EST六种阅读框翻译成蛋白质，接着与蛋白质序列数据库进行比较分析。,Vector N
2、TI 5.2 中的contig ExpressContig Express软件：Sequencer软件： ftp:/ Chromas软件： http:/.au/chromas230.exe,限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。即一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶。是细菌内存在的保护性酶。分为I、II、III三类。,（一）定义：,其中的II类限制性核酸内切酶是重组DNA技术中的重要工具酶。 II类酶识别序列特点为回文结构，大多为 46 bp 回文结构（palindrome s
3、equence）， 如EcoRI 识别序列： 5GAATTC 3 5GGATCC 3 3CTTAAG 5 3CCTAGG 5,限制性核酸内切酶命名,Smith和Nathame命名原则（1973） 属名 + 种名 + 株名 + 流水例如： 流感噬血杆菌d株 （Haemophilus influengae d） Hind Hind Hind Hind ,常用的限制性核酸内切酶酶切序列,限制酶 识别序列及切口 限制酶 识别序列及切口 Alu AG/CT Hind A/AGCTT TC/GA TTCGA/A BamH G/GATCC Sal G/TCGAC CCGAG/G CAGCT/G Bgl A/
4、GATCT Sma CCC/GGG TCTAG/A GGG/CCC EcoR G/AATTC CTTAA/G,sticky end 5 3 5 3 5 3 EcoR GAATTC G AATTC CTTAAG CTTAA G 3 5 3 5 3 5blunt end 5 3 5 3 5 3 Sma CCCGGG CCC GGG GGGCCC GGG CCC 3 5 3 5 3 5,利用NEB Lab在线免费软件分析： http:/ 等其他商业软件均能分析。 以DNAClub为例说明。,四、PCR 引物设计 （包括杂交探针设计）,（一）引物设计的原则 引物要跟模板紧密结合； 引物与引物之间不能有
5、稳定的二聚体或发夹结构存在； 引物不能在别的非目的位点引起高效DNA聚合反应(即错配)。,引物长度（primer length）， 产物长度（product length）， 序列Tm值 (melting temperature)， G值(internal stability)， 引物二聚体及发夹结构（duplex formation and hairpin）， 错误引发位点（false priming site）， 引物及产物GC含量（composition），有时还要对引物进行修饰，如增加限制酶切点，引进突变等。,（二）引物设计需要考虑的因素,（三）引物设计要点,一般引物的长度为15-30
6、bp，常用的长度为18-24bp，过长或过短都不合适。 引物3端的碱基一般不用A，因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高，而其它三种碱基的错误引发效率相对小一些。 引物的GC含量一般为45-55%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。 引物所对应模板序列的Tm值最好在72左右，当然由于模板序列本身的组成决定其Tm值可能偏低或偏高，可根据具体情况灵活运用。,G值反映了引物与模板结合的强弱程度，也是一个重要的引物评价指标。 一般情况下，在Oligo 5.0软件的G值窗口中，引物的G值最好呈正弦曲线形状，即5端和中间部分G值较高，而3端G值相对较低，且不要超过9（G值为负
7、值，这里取绝对值），如此则有利于正确引发反应而可防止错误引发。 其原理，引物与模板应具有较高的结合能量，这样有利于引物与模板序列的整合，因此5端与中间段的G值应较高，而3端G值影响DNA聚合酶对模板DNA的解链，过高则不利于这一步骤。,可能的错误引发位点决定于引物序列组成与模板序列组成的相似性，相似性高则错误引发率高，错误引发的引发率一般不要高过100，最好没有错误引发位点，如此可以保证不出非目的产物的假带。 引物二聚体及发夹结构的能量一般不要超过4.5，否则容易产生引物二聚体带，且会降低引物浓度从而导致PCR正常反应不能进行。 对引物的修饰一般是增加酶切位点，应参考载体的限制酶识别序列确定，
8、常常对上下游引物修饰的序列选用不同限制酶的识别序列，以有利于以后的工作。,推荐使用自动搜索软件（商业软件）： Primer Premier 5.0 推荐使用引物评价软件（商业软件） ：Oligo 6网址：http:/,（四）、引物设计软件的使用,OLIGO 6.0 PCR 引物设计,设计引物的免费在线软件Primer3， 网址: http:/frodo.wi.mit.edu/primer3,我的评价： 是非常优秀的设计引物的软件！ 是真正的“免费的午餐”！ 天上会掉下“馅饼”的?会的!,以一条序列为例，说明其使用方法,五、质粒绘图软件,Winplas （商业软件）pDRAW32软件（商业软件）
9、，其网址：http:/hjem.get2net.dk/acaclone，可以看到演示版和有关信息Vector NTI （商业软件）,Winplas 2.6 质粒构建,Plasmid processor 其免费下载的网址 http:/ http:/www.hytti.uku.fi/%7Eoikari/plasmid.htmlDMUP beta 其免费下载的网址 http:/ http:/ processor质粒作图软件是压缩软件，需要先将其解压到一个目录下（不需安装即可直接应用），然后才能应用。（压缩文件是网络传输的最常用文件，目的是为了传输方便）； 1）在资源管理器中双击Plasmid.exe
10、 文件（553kb)，进入作图的界面； 2）点filenew,在出来的对话框中填上Plasmid name和length,比如分别填 pBR322和4322（bp)（注意不能填4.322kb，否则软件不认识）。点击OK，进入下一个界面，上面是一个圆，标着pBR322和4322bp。 3）点daterestriction site加酶切位点，填酶的名称及定位； 4）点DatemultipleGenes,填基因名称（如E6），位点在500至890处，还是在此对话框中，选择右下角的style选所加基因的格式是箭头还是长的圆弧等格式（根据喜好），选厚薄度（thichness),然后点击此对话框右上部分
11、的Add Gene，在点击done，于是基因就加上了。基因和酶切位点可反复加多次。,5）但本软件缺陷之处上多克隆位点不能直接加，只能通过点daterestriction site加酶切位点，在此对话框中加多克隆酶切位点（如加HinIII, EcoRI,BstI时，点daterestriction site加酶切位点，出现对话框后，HinIII, location比如填1，Add site; Eco R I填3,Add site; Bst填5Add site;然后点击OK. 在圆上将位点15处用鼠标往旁边分别一拖，就可看见这三个位点了。,质粒作图的在线软件PlasMapper2.0,http:/
12、wishart.biology.ualberta.ca/PlasMapper,六、进化树分析软件,MEGA4.0：免费分子进化遗传分析软件免费下载地址: http:/Vector NTI：商业软件,Vector NTI Suit 同源比较主窗口,Vector NTI Suit 同源比较进化树,七、序列的同源性分析软件,Blast ClustalW,Blast简介,BLAST 是由美国国立生物技术信息中心（NCBI） 开发的一个基于序列相似性的数据库搜索程序。 BLAST是“局部相似性基本查询工具”(Basic Local Alignment Search Tool)的 缩写。 http:/ww
13、w.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/(网络版),主要的blast程序,举例说明使用过程,p1MSDNGPQSNQRSAPRITFGGPTDSTDNNQNGGRNGARPKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEELRFPRGQGVPINTNSGPDDQIGYYRRATRRVRGGDGKMKELSPRWYFYYLGTGPEASLPYGANKEGIVWVATEGALNTPKDHIGTRNPNNNAATVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRGNSRNSTPGSSRGNSPARMASGGGETALALLLLDRLNQLESKVSGKGQQQQGQTV
14、TKKSAAEASKKPRQKRTATKQYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQDLIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYHGAIKLDDKDPQFKDNVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKTDEAQPLPQRQKKQPTVTLLPAADMDDFSRQLQNSMSGASADST QA,Clustwal W简介和使用 进行核酸或蛋白质的多序列的比较 网址： http:/www.ebi.ac.uk/clustalw http:/www.ddbj.nig.ac.jp/search/clustalw-e.html,八、ORF Finder （核酸编码蛋白质区域分析软件）,www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf,目前，在国际上，一些优秀的软件根据功能归类被集中在一个网页上，极大地方便了使用。 http:/bioinformatics.weizamann.ac.il/gdp/gdp.html,在国内，很多生物信息学软件来源信息（包括不少免费下载的软件）都可以生物软件网上获得。 http:/www.bio- http:/,
